论文部分内容阅读
本文的研究对象是葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase,GOD）,通过多种技术手段对其热分解过程进行研究,此外,运用PyMOL、Ligplot+软件绘制出酶的直观图,可以清晰看出酶的二聚体结构以及辅基和活性中心位置。同时,采用石墨烯（Graphene）和多壁碳纳米管（Multi-walled Carbon nanotubes,MWCNTs）构建复合材料修饰电极,对GOD进行电化学研究,成功构建GOD在纳米复合材料修饰电极上的直接电化学和对葡萄糖响应灵敏的新型生物传感器。文章分为三个部分:第一部分,设计能稳定测量GOD活力大小的方法。该方法利用光谱学仪器-紫外可见光分光光度计（UV-Vis）进行测量,使用的体系是GOD-辣根过氧化物酶（HRP）-2-甲氧基酚耦联体系,实验结果证明该方法可以测量GOD的活性,多次测量后处理的结果具有稳定性,测得的酶活力为110 2 U/mg,而且酶在该体系下其最适pH值为5.5,与Sigma公司提供的酶活力100 U/mg,最适pH值5.5相符,酶促动力学参数Km值测得为30.0±1.0 mM,此外,实验过程中还使用联甲氧基苯胺方法测量,对比两种方法吸光度的变化。总的来说,运用GOD-HRP-2-甲氧基酚耦联体系测量酶活性,该方法具有操作简便,便于控制,反应现象明显,灵敏度高,重复性好的优点。第二部分,确定测量方法后,利用UV-Vis测量在逐渐升温过程中酶的催化速率变化,再结合构象锁理论,根据实验数据计算出构象锁数目为2,从而推断出酶在逐渐升温过程中的二聚体解聚与聚集过程;在不同温度下温浴并淬火的酶液中加入荧光探针ANS,利用荧光分光光度计在不同温度下测量其荧光强度的变化,荧光探针ANS的荧光强度可以反映出蛋白质疏水环境的变化规律;利用圆二色谱仪测量酶在逐渐升温过程中的摩尔椭圆率的变化,通过CDNN软件计算出α-螺旋含量的变化,数据显示在活性拐点温度之后,随温度上升α-螺旋含量逐渐减小,同时利用圆二色谱仪测量不同pH值下酶的α-螺旋含量变化,数据显示在pH值在5.5时α-螺旋含量是最高的,说明在此环境下酶的稳定性是最好的;利用纳米颗粒分析仪测量不同温度下酶液的粒径,可以看出粒径先减小而后增大,说明该过程为先解体而后聚合过程。第三部分,本文中成功构建了葡萄糖（Glucose）电化学传感器,运用纳米材料MWCNTs和Graphene修饰玻碳（GC）电极,纳米复合材料更加有利于电极表面与GOD活性中心的电子传递,利用傅里叶红外光谱仪（FT-IR）和UV-Vis定性分析两种材料对GOD的生物相容性能力,利用循环伏安法（Cyclic Voltammetry,CV）来测量酶在修饰电极上的电化学和电催化反应进程,利用线性伏安法（Linear Sweep Voltammetry,LSV）测量酶对Glucose的检测,实验结果表明,纳米材料与GOD有较好的生物相容性,在该体系下进行的反应是直接、准可逆的氧化还原反应,有较好的氧化还原峰,电子传递速率常数ks为0.87 s-1,电活性物质表面密度Г为1.54×10-10 mol/cm-2,动力学表观米氏常数Kmapp为4.09×102μM,检测限为39μM,线性检测范围为:40-1000μM,对修饰电极的稳定性进行实验,结果表明该电极具有很好的稳定性,放置一天一夜后信号衰减很小,同时做了电极检测抗干扰实验,结果表明修饰电极在检测底物时有较好的抗干扰能力,在实验室条件下成功构建出能够检测Glucose浓度的第三代生物传感器。