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肺癌死亡率在世界范围内居恶性肿瘤首位,虽然近年来出现了一些治疗新进展,其治愈率仍然＜15%。HER2/neu（erbB2）基因,为表皮生长因子受体（EGFR）家族成员,其编码蛋白为185KDa,具有酪氨酸蛋白激酶活性,与EGFR高度同源。研究显示,HER2/neu介导的信号传导与肿瘤的形成、增殖、转移、侵袭及放化疗耐药有关。约1/3非小细胞肺癌（NSCLC）存在HER2/neu过表达,HER2/neu过表达在NSCLC形成、增殖、转移、侵袭等方面的作用尚不完全清楚。RNA干涉（RNAi）是双链RNA（dsRNA）介导的、序列特异的转录后基因沉默（PTGS）现象,广泛存在于多种自然界。目前,RNAi技术已发展成为一种新型的基因阻断技术,用于高效特异地关闭或降低特定基因的表达,广泛用于新基因筛选、基因功能鉴定以及基因治疗等方面,均显示了非常广阔的应用前景。目前,HER2/neu表达对NSCLC细胞株A549细胞增殖的影响尚不明了,本研究通过RNAi抑制HER2/neu表达,阐明HER2/neu基因在肺癌A549细胞增殖中的作用,探讨HER2/neu作为NSCLC治疗靶点的可行性。研究目的本研究利用RNAi沉默肺癌A549细胞HER2/neu表达后,通过体外实验观察肺癌A549细胞增殖能力的变化,了解HER2/neu基因在肺癌细胞增殖中的作用,为通过RNA干涉HER2/neu基因表达治疗NSCLC提供一条新思路。研究内容1.根据人HER2/neu mRNA基因编码区序列,设计并合成针对HER2/neu的1条29nt的小发夹RNA（shRNA）模板脱氧寡核苷酸序列,首先构建针对HER2/neu的siRNA表达质粒psilence 3.1-HER2,并进行酶切鉴定和DNA测序;2.利用RT-PCR和Western Blot方法对RNAi质粒转染肺癌A549细胞进行了HER2/neu mRNA和蛋白表达水平的检测,明确RNAi质粒转染对mRNA和蛋白表达水平的抑制效率。3.观察RNAi质粒转染肺癌A549细胞的增殖能力变化:将转染24h并经潮霉素筛选3 d后的肺癌A549细胞用于实验。FCM检测细胞周期分布;MTT法绘制细胞生长曲线观察体外细胞的增殖能力。结果1.酶切鉴定结果显示重组质粒的插入片段大小与预期相符,表明寡脱氧核苷酸片段已克隆入重组质粒;DNA测序证实该重组质粒序列与所设计序列完全一致,表明针对HER2/neu的siRNA表达载体已构建成功,重组质粒分别命名为psilence 3.1-HER2。2.RT-PCR和Western Blot检测结果显示:psilencer 3.1-HER2转染肺癌A549细胞后,HER2/neu mRNA和蛋白表达水平的抑制率分别达到74%、72%,表明psilencer 3.1-HER2转染可以有效抑制HER2/neu基因表达。3.psilencer 3.1-HER2转染对肺癌A549细胞增殖能力变化:FCM结果显示psilencer 3.1-HER2转染组细胞G0/G1期细胞增加,S期细胞减少;细胞生长曲线右移、增殖速度明显减慢。表明抑制HER2/neu基因表达后肺癌A549细胞增殖能力明显减弱。结论1.设计、合成了一个针对HER2/neu的特异性RNAi寡脱氧核苷酸序列,成功构建了针对HER2/neu基因的RNAi真核表达载体。2.RNAi表达载体转染可有效抑制内源性基因的表达:本研究中质粒psilencer 3.1-HER2转染可以有效抑制HER2/neu mRNA和蛋白水平的表达。3.体外功能实验结果表明,我们设计的针对HER2/neu的重组质粒转染阻滞细胞于G0/G1期,并显著抑制细胞增殖。综上所述,针对HER2/neu的RNAi在肺癌的基因治疗中具有潜在应用价值,有望为肺癌的基因治疗提供一种新思路。