[研究背景]肺癌是当今世界上人们所面临的严重威胁生命与健康的最常见的恶性肿瘤之一,已成为各种恶性肿瘤死亡的首要原因。在所有肺癌患者中,约75%-80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),其中75%的NSCLC患者在确诊时已属晚期,没有手术指征。目前NSCLC的治疗主要是以手术为主的、包括化疗、放疗和分子靶向治疗等,但无论是采用何种治疗方法,都需要一些有效指标来指导和评价NSCLC的治疗效果。目前,在临床上广泛应用的评价指标是肺癌的TNM分期,这个分期曾经为临床NSCLC的治疗和预后判断提供了一定的指导价值。但是在临床工作中经常发现处在相同分期的患者中,有部分的预后与预期是不相同的。临床有相当一部分NSCLC患者(如：Ⅰ期NSCLC患者,术后5年生存率仅为60%-70%),尽管都得到了早期的诊断和相同的治方法疗,但结果却短期内出现了复发和转移,生存期明显缩短,无疑这些患者的肿瘤在生物学行为特点方面是不相同的,表现为更具有侵袭性。因此,如果单纯以TNM分期来判断肺癌的预后和进一步指导治疗显然是不够完善的。近年来研究发现,从肺癌的早期发生如支气管上皮增生到肺癌细胞的生长、侵袭、转移及预后复发都与血管生成有密切关系。和其他实体肿瘤一样,新生血管为肺癌提供营养物质,促进肿瘤的生长,是肿瘤侵袭转移的前提条件。肿瘤血管的生成涉及到多种基因的突变和不同细胞因子及受体的表达,受正负两方面因素的调控。在肿瘤组织中,由于促血管生成因子和抗血管生成因子二者之间平衡失调,血管生成促进因子占优势,促进肿瘤滋养血管的形成。血管内皮生长因子C是目前所知的作用最强的促血管生成因子,参与血管生成的多个环节。在促进肿瘤微血管生成方面起着重要作用。NSCLC组织中血管内皮生长因子C的表达及肿瘤微血管密度(MVD)可能与NSCLC的生物学行为及预后相关,针对血管内皮生长因子C及其受体的靶向治疗有可能成为NSCLC的一种新的治疗途径,已经成为目前研究的热点。目的：研究血管内皮生长因子C (vascular endothelial cell growth factor C, VEGF-C)在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)中的表达情况,并检测经VEGF-C反义寡合苷酸转染的肺癌细胞株A-549的体外侵袭能力和其VEGF-C的表达变化。方法：(1)应用基因克隆技术制备互补脱氧核糖核酸(cDNA),并将其定向克隆入质粒中,转化感受态大肠杆菌,获取有重组质粒的阳性转化子,体外制备地高辛标记的VEGF-C cRNA探针,采用原位杂交技术,检测VEGF-C mRNA在非小细胞肺癌中的表达情况。(2)将VEGF-C反义脱氧核苷酸转染人肺癌细胞株A-549,检测癌细胞体外粘附能力和侵袭能力,并应用Western blot技术检测细胞VEGF-C蛋白的表达。结果：(1)用经逆转录反应仅合成一条cDNA链的总RNA为模板,以VEGF-C基因特异性的引物进行PCR扩增后,出现了一条与大小在1.1kb左右的特异性条带；用EcoR I和Xho I双酶消化小量制备的质粒,见重组质粒含有1.1kb的插入片段；对阳性克隆质粒上的插入片段进行全序列测定,与人VEGF-C基因cDNA全序列几乎一致；VEGF-C mRAN在肺鳞癌和腺癌中都有一定程度的表达,主要分布于肺癌细胞、血管内皮细胞和纤维母细胞,阳性表达率分别为65.4%(17/26)和59.1%(13/22)。(2)经VEGF-C ASODN转染的肺癌细胞株A-549体外粘附率在同一时间点与对照组相比明显降低(0.15±0.01,0.29±0.02,0.49±0.02,0.76±0.01),有显著统计学差异(P<0.01)；48小时浸润细胞数目明显减少(58.6±9.2),对重组基底膜体外侵袭力明显减弱(P<0.01)；VEGF-C蛋白表达水平(0.15±0.01)明显下降(P<0.01)。结论：(1) VEGF-C mRNA在非小细胞肺癌中存在一定程度的表达；(2)在体外实验中,VEGF-C反义脱氧寡核苷酸通过下调VEGF-C蛋白的表达抑制肺癌细胞的侵袭作用。第-部分VEGF-基因的克隆化及其耐诩A在非小细胞肺癌组织中的表达分布目的:探讨VEGF-C在SNCCL中的表达。方法:(1)应用基因克隆技术制备互补脱氧核糖核酸(DcN)A;()2定向克隆入质粒中,转化感受态大肠杆菌,获取有重组质粒的阳性转化子,体外制备地高辛标记的VEGF-C。NRA探针;(3)采用原位杂交技术,检测VEGF-CmRNA在非小细胞肺癌中的表达情况。结果:(1)用经逆转录反应仅合成-条。DNA链的总RNA为模板,以vEGF-C基因特异性的引物进行PRC扩增后,出现了-条与大小在1.Ikb左右的特异性条带;(2)用EcoRI和Xh0I双酶消化小量制备的质粒,见重组质粒含有1.Ikb的插入片段;(3)对阳性克隆质粒上的插入片段进行全序列测定,与人EVGF-C基因cDAN全序列几乎-致;(4)VEGF-CmARN在肺鳞癌和腺癌中都有-定程度的表达,主要分布于肺癌细胞、血管内皮细胞和纤维母细胞,阳性表达率分别为56.4%(17/2)6和59.1%(13/22)。结论:VEGF-CmNRA在非小细胞肺癌中存在-定程度的表达;第二部分VEFG-C反义寡核昔酸对人肺癌细胞株侵袭抑制作用的研究目的:检测经VGEF-C反义寡合昔酸转染的肺癌细胞株A-549细胞的体外侵袭能力和VEGF-C的表达变化。方法:(1)将VEGF-C反义脱氧核昔酸转染人肺癌细胞株A-594,检测癌细胞体外粘附能力和侵袭能力;()2并应用Westernblot技术检测细胞VEGF-C蛋白的表达。结果:(1)经VGEF-CASODN转染的肺癌细胞株A-594体外粘附率在同-时间点与对照组相比明显降低(0.15士0.01,0.29土0.02,0.49士0.02,0.76士0.01),有显著统计学差异(P<O.10);(2)48小时癌细胞浸润细胞数目明显减少(58.6士9.)2,对重组基底膜体外侵袭力明显减弱(<PO.10);(3)VGEF-C蛋白表达水平(0.51士0.01)明显下降(<P0.01)。结论:在体外实验中,VEGF-C反义脱氧寡核普酸通过下调VEGF-C蛋白的表达抑制肺癌细胞的侵袭作用。