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研究背景:ER是核受体的超家族成员之一,它在乳腺正常发育及乳腺癌的发生和发展中有重要调节作用。乳腺癌的发生及发展与雌激素(E2)和雌激素受体(ER)密切相关。在细胞核中的ER可以直接与靶基因启动子区的雌激素反应元件(ERE)结合并且通过募集一些辅调节蛋白(包括核受体辅激活蛋白和辅阻遏蛋白)调节基因转录,这就是通常所指的ER基因组活性(ER genomic activity)。此外,近期的研究显示,位于胞膜和胞浆的ER还可以介导快速的非基因组活性(ER non-genomic activity)。该活性和HER2途径之间可进行广泛的“串话(Cross-talk)”或相互作用,活化的其下游信号分子MAPK和Akt,其结果使包括HER2途径相关基因在内的众多基因的表达被增强,这些基因产物,反过来进一步加强HER2途径,导致细胞不依赖于E2的生长,使针对E2和ER的内分泌治疗出现抵抗。因此,ER非基因组活性被认为是导致乳腺癌内分泌治疗抵抗非常重要的机制。此外,ER的非基因组活性参与了乳腺癌众多的基因调控,例如,E2通过ER非基因组活性快速激活SphK1(鞘氨醇激酶),调节乳腺癌细胞的细胞增殖,迁移和血管的发生。E2可以通过非基因组活性增加Ca2+依赖的K+通道传导力活性,从而调节乳腺癌细胞的增殖。
瓣状核酸内切酶(FEN1)是近期发现与ER介导的转录调节和DNA修复也密切相关的辅调节蛋白成员之一。最近研究显示,FEN1基因与乳腺癌的发生也有密切相关性。与相应正常乳腺组织相比,FEN1在乳腺癌中过度表达。我们的前期工作发现FEN1在乳腺癌细胞中的过表达受E2的调节,并增强了乳腺癌细胞增殖,但FEN1的表达受E2上调的信号机制尚未阐明。我们的生物信息学预测发现,FEN1基因启动子区没有ER的直接结合位点,但是有4个潜在的转录因子Elk-1结合位点,我们则推测:E2上调FEN1基因的表达也许不是通过经典的调节方式,即ER直接结合到FEN1的基因启动子区(基因组活性)而是通过位于胞膜或者胞浆的ER介导的非基因组活性实现的;结合前期的实验结果,E2上调MCF-7乳腺癌细胞中FEN1启动子的活性依赖于细胞中全长的Elk-1,因此,我们推测E2可能是通过ER-MAPK-Elk-1这种快速非基因组途径上调了FEN1的表达。
Herceptin/Trastuzumab(中文商品名“赫赛汀”)是针对HER2的人源化单克隆抗体,能有效抑制HER2过表达的乳腺癌细胞的生长和增殖,但临床Herceptin抵抗十分常见。目前产生Herceptin抵抗的确切机制尚不完全清楚。鉴于①作为Herceptin治疗靶点的HER2途径,由于可被位于胞膜或胞浆的ER通过非基因组活性激活,势必增加Herceptin的有效抑制剂量,从而减弱Herceptin的治疗效果。②已有研究报道,在其他ER阳性的非乳腺癌细胞中,位于胞膜或胞浆的ER还可通过非基因组活性直接与IGF-1R和PI3K/Akt相互作用,从而激活IGF-1R和Akt;而Akt和IGF-1R的激活,根据报道本身就是导致Herceptin抵抗的表型产生的机制之一。这些证据均支持ER非基因组活性在ER阳性乳腺癌细胞Herceptin治疗抵抗中可能发挥了潜在的作用。
研究内容:(1)采用RT-PCR、Western blot、EMSA、ChIP分析等技术研究E2通过ER-MAPK-Elk-1途径上调乳腺癌组织中FEN1基因表达的信号机制。(2)采用细胞转染分析、RT-PCR、Western blot、免疫荧光结合激光共聚焦分析和CoIP等技术研究ER非基因组活性对ER阳性乳腺癌细胞Herceptin疗效的影响及机制。
研究结果:
(一)ER非基因组活性上调乳腺癌FEN1基因表达机制研究:
(1)E2可以上调乳腺癌细胞中FEN1表达。
(2)E2可以通过非基因组活性激活MAPK和Elk的磷酸化。
(3)E2对FEN1表达的上调作用是通过Elk-1结合到FEN1启动子的SRE位点上实现的。
(4)乳腺癌中ER和FEN1以及磷酸化MAPK和Elk-1的表达均高于癌旁组织,在临床样本中进一步证实E2上调FEN1是通过ER-MAPK-Elk-1这一非基因组信号转导通路实现的。
(二)ER非基因组活性在Hereceptin治疗抵抗中的作用以及机制研究:
(1)E2和生长因子Heregulin都可以快速上调磷酸化MAPK和AKT的表达。
(2)Herceptin可以抑制Heregulin诱导的MAPK和AKT磷酸化。
(3)E2能干扰Herceptin抑制Heregulin诱导的MAPK和AKT磷酸化的作用
(4)ER与IGF-1R存在相互作用并且定位于胞浆或胞膜,表明IGF-1R可能也能被E2通过ER非基因组活性快速激活。
结论:(1)E2可通过ER非基因组活性,即ER-MAPK-Elk-1途径上调乳腺癌细胞中FEN1的表达。(2)E2能通过ER基因组活性干扰ER阳性乳腺癌的Herceptin抑制效应。
研究目的和意义:(1)本研究为E2上调FEN1的表达提供了一个全新的信号机制,可解释临床观察到的乳腺癌组织过表达FEN1的原因。同时,结合前期的研究结果,可确定FEN1作为乳腺癌患者进程的潜在标志物的作用,阐明同样作为乳腺癌标志物的E2、ER与FEN1在影响乳腺癌进程中的相互关系。加深对FEN1基因表达调控和乳腺癌发病机制的认识,并为临床寻找增强乳腺癌化疗敏感性的新措施提供理论依据。(2)阐明E2可通过ER非基因组活性干扰ER阳性乳腺癌细胞Herceptin疗效和机制,可为临床Herceptin治疗抵抗的研究提供一个新的重要机制,并可为临床Herceptin与内分泌治疗联合治疗策略提供新的理论依据。