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目的:心脏骤停是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。心跳骤停后综合征包括脑损伤、心肌功能障碍、全身缺血/再灌注反应和持续诱发性病变等,其中脑损伤是导致复苏成功患者预后不良的主要因素。心跳骤停后全脑缺血/再灌注引发神经元细胞死亡,导致不可逆的脑损伤。目前尚无有效的药物改善心跳骤停后脑损伤患者的神经元细胞死亡和神经功能障碍。研究表明,细胞焦亡是心跳骤停后神经病理损伤的一个关键机制。神经元焦亡又称细胞炎性坏死,是神经损伤的重要原因之一。神经元焦亡需要nod样受体家族蛋白3（NLRP3）将caspase-1前体裂解为活性caspase-1。成熟的caspase-1裂解Gasdermin D（GSDMD）形成直接渗透质膜的孔,导致神经元死亡。特别是最近的研究表明,NLRP3炎性小体诱导的细胞焦亡是塑造心跳骤停复苏后神经病理损伤的关键事件。因此,抑制NLRP3介导的细胞焦亡是心跳骤停复苏后脑损伤的一种潜在治疗方法。近年来发现多种G蛋白偶联受体（GPCRs）通过神经递质或代谢产物参与NLRP3炎性小体的激活,表明GPCRs信号是NLRP3炎性小体的关键调节因子。有趣的是,GABAB受体是神经递质GABA的代谢型GPCRs,由GABAB1和GABAB2亚基组成。因此,GABAB受体在调节NLRP3炎性小体的激活方面具有潜在的作用。GABAB受体是负责协调中枢神经系统的缓慢抑制性神经传递受体。临床前研究已在脑缺血动物模型和神经元培养模型中证实了GABAB受体特异性激动剂—巴氯芬的神经保护作用。然而,很少有研究探讨激活GABAB受体在心跳骤停复苏后脑损伤中的作用。在本研究中,我们假设在心跳骤停复苏后,激活GABAB受体可以改善神经元死亡和神经功能障碍。我们通过窒息性心跳骤停大鼠模型和缺氧缺糖/复氧复糖（OGD/R）神经元细胞模型验证激活GABAB受体对神经行为以及神经元细胞存活率的影响以及GABAB受体与神经元焦亡之间的调控关系,并通过进一步实验验证GABAB受体影响神经元焦亡的具体机制。本研究为临床心跳骤停复苏后脑损伤的治疗提供理论依据。方法:1:健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠,体重为300-350g。（1）为了探索不同剂量的巴氯芬对心跳骤停复苏后脑损伤大鼠神经行为异常的影响,随机将大鼠分成5组（n=20/组）:sham组（假手术组）,CA组（心跳骤停组）,BCA-5组（心跳骤停+5mg/kg巴氯芬组）,BCA-10组（心跳骤停+10mg/kg巴氯芬组）,BCA-20组（心跳骤停+20mg/kg巴氯芬组）。除sham组外,其余各组分别进行窒息10分钟心跳骤停处理。复苏后,BCA-5组,BCA-10组,BCA-20组分别腹腔注射巴氯芬5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg。采用改良神经功能缺损评分（m NSS）和旷场实验评估大鼠自主行为能力以及神经功能。（2）在神经元细胞中分别给予巴氯芬10μM,25μM,50μM,100μM,200μM（n=6/组）,通过CCK-8实验观察巴氯芬对神经元细胞活性的影响。在OGD/R细胞模型中分别给予巴氯芬50μM,100μM,200μM,观察巴氯芬对OGD/R模型神经元细胞活性的影响。（3）为了观察最佳治疗剂量的巴氯芬对激活GABAB受体、神经元损伤以及神经炎症的影响（n=6/组）,心跳骤停复苏后24小时用western blotting法和q RT-PCR检测sham组,CA组和BCA组（心跳骤停+20mg/kg巴氯芬组）大鼠海马和皮层GABAB受体的表达,TUNEL染色检测海马和皮层细胞死亡情况,Nissl染色观察大鼠海马和皮层的细胞损伤情况。2:（1）为了观察细胞焦亡关键分子在心跳骤停复苏后脑内不同时间点的表达情况,随机将大鼠分成5组（n=6/组）:sham组（假手术组）,CA-12h组（心跳骤停复苏后12小时组）,CA-24h组（心跳骤停复苏后24小时组）,CA-48h组（心跳骤停复苏后48小时组）,CA-72h组（心跳骤停复苏后72小时组）。用western blotting法检测脑内不同时间点NLRP3和GSDMD的表达情况。（2）为了观察细胞焦亡关键分子在OGD/R后不同时间点的表达情况,随机将神经元细胞分成4组（n=6/组）:control组（对照组）,OGD/R 6h组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时组）,OGD/R12h组（缺氧缺糖/复氧复糖后12小时组）,OGD/R 24h组（缺氧缺糖/复氧复糖后24小时组）。用western blotting法检测细胞模型不同时间点NLRP3,caspase-1和GSDMD的表达情况。（3）为了观察巴氯芬对心跳骤停复苏后大鼠海马和皮层神经元焦亡的影响,心跳骤停复苏后24小时用western blotting法,q RT-PCR,免疫荧光染色检测sham组,CA组和BCA组（心跳骤停+20mg/kg巴氯芬组）大鼠海马和皮层焦亡相关分子caspase-1和GSDMD的表达和定位情况（n=6/组）。（4）为了观察巴氯芬对OGD/R后神经元焦亡的影响,OGD/R 6小时后用western blotting法,q RT-PCR,免疫荧光染色检测control组,OGD/R组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时组）和OB组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时+巴氯芬组）神经元细胞GABAB受体,caspase-1和GSDMD的表达情况（n=6/组）。3:（1）为了观察巴氯芬对心跳骤停复苏后大鼠海马和皮层DDX3X/NLRP3通路的影响,随机将大鼠分成3组（n=6/组）:sham组（假手术组）,CA组（心跳骤停组）,BCA组（心跳骤停+20mg/kg巴氯芬组）。心跳骤停复苏后24小时用western blotting法,q RT-PCR,免疫荧光染色检测大鼠海马和皮层DDX3X和NLRP3的表达和定位情况。（2）为了观察巴氯芬对OGD/R后DDX3X/NLRP3通路的影响,随机将神经元细胞分成3组（n=6/组）:control组（对照组）,OGD/R组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时组）和OB组（OGD/R+巴氯芬组）。OGD/R后用western blotting法,q RT-PCR,免疫荧光染色检测神经元细胞DDX3X和NLRP3的表达情况。4:为了观察给予nigericin后巴氯芬对OGD/R神经元焦亡的影响,随机将神经元细胞分成5组（n=6/组）:control组（对照组）,OGD/R组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时组）,OGD/R+Baclofen组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时+巴氯芬组）,OGD/R+nigericin组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时+尼日利亚菌素组）,OGD/R+Baclofen+nigericin组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时+巴氯芬+尼日利亚菌素组）。OGD/R后用LDH和CCK-8法检测各组神经元细胞存活率,western blotting法检测各组细胞NLRP3,caspase-1和GSDMD的表达情况。5:为了观察过表达DDX3X后巴氯芬对OGD/R后神经元细胞内NLRP3激活的影响,随机将神经元细胞分成5组（n=6/组）:control组（对照组）,OGD/R组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时组）,OGD/R+Baclofen组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时+巴氯芬组）,OGD/R+OE-DDX3X组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时+过表达DDX3X组）,OGD/R+Baclofen+OE-DDX3X组（缺氧缺糖/复氧复糖后6小时+巴氯芬+过表达DDX3X组）。OGD/R后用western blotting法检测各组细胞DDX3X和NLRP3的表达情况。结果:1:（1）与sham组比较,心跳骤停复苏后24小时,48小时和72小时大鼠m NSS评分明显增加,且在24小时增加最显著。（2）与sham组比较,CA组大鼠总运动距离明显减少（p＜0.01）。与CA组比较,BCA-10组和BCA-20组大鼠总运动距离明显增加（p＜0.05,p＜0.01）。与sham组比较,CA组大鼠在中央区的停留时间和进入次数明显减少（p＜0.01）。与CA组比较,BCA-10组和BCA-20组大鼠在中央区的停留时间和进入次数明显增加（p＜0.05,p＜0.01）。与sham组比较,CA组大鼠辨别物体新位置的能力明显减弱（p＜0.01）。与CA组比较,BCA-20组大鼠辨别物体新位置的能力明显增强（p＜0.01）。与sham组比较,CA组大鼠辨别新物体的能力明显减弱（p＜0.01）。与CA组比较,BCA-10组和BCA-20组大鼠辨别新物体的能力明显增强（p＜0.05,p＜0.01）。与sham组比较,CA组m NSS神经功能缺损评分显著增加（p＜0.01）。与CA组比较,BCA-10组和BCA20组m NSS神经功能缺损评分显著降低（p＜0.05,p＜0.01）。（3）CCK-8结果显示与control组相比,巴氯芬浓度为100μM和200μM时,正常细胞存活率显著增加（p＜0.05,p＜0.01）。与control组相比,OGD/R组细胞存活率显著降低,与OGD/R组相比,OGD/R后用200μM巴氯芬干预的细胞存活率显著增加（p＜0.01）。（4）Western blotting和q RT-PCR结果显示,与sham组比较,CA组海马和皮层GABAB受体的表达水平显著降低（p＜0.01）,而给予巴氯芬后表达水平显著升高（p＜0.01）。（5）TUNEL结果显示,与sham组相比,CA组大鼠海马和皮层细胞凋亡明显增多（p＜0.01）。BCA组加入巴氯芬后,与CA组比较,细胞死亡明显减少（p＜0.01）。Nissl染色结果显示sham组海马和皮层细胞结构完整,染色均匀,组织结构完整,细胞中心细胞核清晰。相反,CA组表现出组织结构紊乱、空泡损伤和较深的染色。然而,巴氯芬治疗减轻了这种病理损伤。2:（1）动物模型western blotting结果显示,与sham组相比,CA-12h,CA-24h,CA-48h和CA-72h的NLRP3和GSDMD的蛋白水平显著升高,但NLRP3和GSDMD在CA-24h与sham组相比升高最显著（p＜0.01）。（2）免疫荧光结果显示心跳骤停复苏后GSDMD与小胶质细胞标记物Iba-1共表达,但大多数并不在小胶质细胞中。进一步实验发现,GSDMD主要与神经元共表达。（3）细胞模型western blotting结果显示,与control组相比,OGD/R后6小时NLRP3和caspase-1的蛋白水平显著升高（p＜0.01）,随着时间的增加而下降。GSDMD分别在6小时和24小时蛋白水平与control组相比显著升高（p＜0.01）。（4）动物模型western blotting结果显示,与sham组比较,CA组海马和皮层caspase-1和GSDMD的蛋白水平显著升高（p＜0.01）,但这些升高被巴氯芬显著减弱（p＜0.01）。q RT-PCR和免疫荧光结果发现类似结果。（5）细胞模型western blotting、q RT-PCR和免疫荧光结果显示与control组比较,OGD/R组GABAB受体表达显著降低（p＜0.01）,与OGD/R组比较,OB组GABAB受体表达显著升高（p＜0.01）。Western blotting结果显示,与control组比较,OGD/R组caspase-1和GSDMD的蛋白水平显著升高（p＜0.01）,与OGD/R组比较,OB组caspase-1和GSDMD的蛋白水平显著降低（p＜0.01）。q RT-PCR结果显示,与control组比较,OGD/R组caspase-1的表达显著增加（p＜0.01）,与OGD/R组比较,OB组caspase-1的表达显著减少（p＜0.01）。3:（1）动物模型western blotting和q RT-PCR结果显示,与sham组比较,CA组海马和皮层DDX3X和NLRP3的表达水平显著增加（p＜0.01）。与CA组比较,BCA组海马和皮层DDX3X和NLRP3的表达显著减少（p＜0.01）。免疫荧光结果显示,与sham组比较,CA组海马和皮层神经元上NLRP3的表达显著增加（p＜0.01）,与CA组比较,BCA组NLRP3的表达显著减少（p＜0.01）。（2）细胞模型western blot、q RT-PCR和免疫荧光结果显示与control组比较,OGD/R组DDX3X和NLRP3的表达水平显著升高（p＜0.01）,与OGD/R组比较,OB组DDX3X和NLRP3的表达水平显著降低（p＜0.01）。4、细胞模型CCK-8,LDH和western blotting结果显示与OGD/R组相比,仅由nigericin激活的NLRP3加重了细胞死亡（p＜0.01）,这与NLRP3、caspase-1和GSDMD的表达升高有关（p＜0.01）。巴氯芬和nigericin的联合给药不仅消除了巴氯芬的保护作用,而且抵消了nigericin对NLRP3的药理学激活的有害作用。5、细胞模型western blotting结果显示与OGD/R组比较,OGD/R+OE-DDX3X组DDX3X和NLRP3的表达水平显著升高（p＜0.01）,与OGD/R+Baclofen组比较,OGD/R+Baclofen+OE-DDX3X组DDX3X和NLRP3的表达水平显著升高（p＜0.01）。结论:（1）激活GABAB受体能够改善心跳骤停复苏后神经功能障碍,减轻心跳骤停复苏后脑内神经元死亡;（2）心跳骤停复苏后脑内存在神经元焦亡;激活GABAB受体改善大鼠心跳骤停复苏后神经元焦亡;（3）激活GABAB受体通过DDX3X/NLRP3通路调控神经元焦亡。