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背景与目的:氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans,T.f)是1947年分离出来的新菌种,这是一种专性自养及极端嗜酸性的硫杆菌,它广泛分布在土壤、海水、硫磺泉以及沉积泉中,广泛应用于低品位铜矿、铀矿以及其他多种贵金属的浸出和回收,它是目前生物冶金中研究最多、最有经济效益的浸矿微生物。但是,由于该菌生长缓慢、细胞得率低,而且对铀、氟等一些离子缺乏抗性,所以在实际应用中限制了其应用范围,同时也对研究工作带来很多不便。本实验通过分子生物学技术,克隆抗氟基因flr-4,将其导入T.f1中,以期获得稳定遗传的抗氟基因工程菌。方法:1.应用RT-PCR技术,从秀丽隐杆线虫中克隆抗氟基因(flr-4),构建pET30a-flr-4原核表达载体,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用SDS-PAGE及Western blot检测Flr-4蛋白的表达,通过生长动力学曲线,检测大肠杆菌抗氟能力的变化。2.构建pJRD215-flr-4载体,将其导入大肠杆菌SM10后,利用接合转移技术,将载体导入T.f1,检测pJRD215-flr-4的遗传稳定性,比较野生型T.f1和重组T.f1菌株在不同氟离子浓度条件下生长动力学曲线。结果:1.克隆了抗氟基因flr-4,构建了原核表达载体pET30a-flr-4,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)后,检测到大肠杆菌中有特异性的融合蛋白的表达。野生型大肠杆菌BL21(DE3)在NaF为9.6g/L的TB培养基中生长受到抑制,而有融合蛋白Flr-4表达的重组大肠杆菌BL21(DE3)其生长不受影响。2.构建了pJRD215-flr-4载体,通过接合转移导入T.f1,野生型T.f1在NaF浓度为40mg/L以上就不再生长,而且在NaF浓度为20mg/L时到达稳定期时间为8天,重组T.f1在NaF浓度为60mg/L的情况下仍能生长,且在NaF浓度为20mg/L的情况下到达稳定期由原来8天缩短为4天。将重组T.f1在无选择压力的条件下,连续传代50代,质粒保留70%以上。结论:1.通过RT-PCR技术从秀丽隐杆线虫中克隆出抗氟基因flr-4,构建了原核表达载体pET30a-flr-4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中。2.利用SDS-PAGE和Western blot技术检测到融合蛋白Flr-4在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达,并证实了抗氟基因的表达增强了大肠杆菌的抗氟能力。3.构建了pJRD215-flr-4表达载体,通过接合转移将载体导入到氧化亚铁硫杆菌T.f1中,获得了遗传稳定的抗氟基因工程菌,T.f1基因工程菌的抗氟能力提高了200%以上。