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嗜盐菌是指在高盐环境中生存的微生物的总称。在长期的进化过程中,嗜盐和耐盐微生物主要通过两种机制来维持细胞和周围环境的渗透压平衡,防止细胞脱水而裂解死亡,包括细胞质积累无机离子的方式和有机相容性溶质的机制。嗜盐古菌和极端嗜盐菌主要采用细胞内积累K+和Cl-的策略来平衡外界的渗透压,中度嗜盐菌则主要是细胞内积累相容性溶质的机制来抵御高盐环境。其中,四氢嘧啶是好氧的中度嗜盐菌中分布最广泛的相容性溶质。由于四氢嘧啶能作为细胞的保护剂、酶的稳定剂和DNA、蛋白质等生物大分子的保护剂,帮助细胞抵抗高温、冷冻、干燥、高盐、辐射和氧自由基等逆境,因此四氢嘧啶在酶制剂、PCR稳定剂、化妆品、精细化工和制药行业有广泛的应用前景而倍受关注。四氢嘧啶合成基因簇ectABC已经在很多种属中成功克隆鉴定,从分子水平上研究嗜盐菌耐盐调控的分子机制,将耐盐基因片段转入植物中,构建抗旱的基因工程菌株和作物新品种,对于改善我国盐碱旱的土壤具有重要的意义。同时将耐盐的基因工程菌株用于高盐有机废水的生物治理,具有重要的经济利用价值。本研究从青海湖20份水样中利用RM高盐选择性培养基筛选得到35株嗜盐菌,选取其中一株优势中度嗜盐菌QHL1作为进一步研究的材料。形态学和生理生化特征研究结果表明：QHL1菌落呈规则圆形、土黄色、透明、中心突出、边缘光滑、形态居中。显微形态呈短杆状,单个或者成串排列,革兰氏染色阴性。菌株QHL1能利用果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、酵母抽提物、蛋白胨、铵盐、尿素和硝酸盐作为碳氮源,不能利用蜜二糖、松三糖、木糖醇和亚硝酸钠。甲基红试验、明胶试验、吲哚试验等重要检测指标均为阴性,氧化酶试验阳性、不产H2S、嗜盐性试验阳性。生长特性研究结果显示：QHL1的生长盐度为0.04-2.74 mol/L,最适生长盐度为0.86 mol/L;生长温度为10～45℃,最适生长温度为37℃；生长pH为4.5-10,最适生长pH为8.5。16S rDNA分子鉴定结果显示：嗜盐菌QHL1的16S rDNA大小为1420bp, BLAST比对分析,菌株QHL1与Halomonas sp. TNB158 (No. AB166899)相似性最高,达到99%。通过形态学、生长特性和生理生化特征结合16S rDNA的鉴定结果,初步认定菌株QHL1属于盐单胞菌属(Halomonas)。利用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)对嗜盐菌QHL1胞内的四氢嘧啶的含量进行定性和定量的测定,其中薄层层析结果显示Rf为0.31,与四氢嘧啶标准品一致,说明QHL1是一株积聚四氢嘧啶的盐单胞菌。高效液相色谱结果显示嗜盐菌QHL1胞内的四氢嘧啶含量约为269.9μg/mL。设计保守基因ectB的引物,以嗜盐菌QHL1的基因组DNA为模板,PCR扩增获得ectB基因。根据已知的ectB基因序列分别设计三条同向的特异性引物,运用染色体步移技术克隆得到四氢嘧啶合成基因簇ectABC及其侧翼序列。DNAStar软件对克隆得到的序列进行ORF分析,结果表明有3个开放阅读框,且ectA、 ectB和ectC位于同一个操纵子上,大小分别为579bp、1269bp和390bp,预测分别编码192、422和129个氨基酸的肽链；同源性分析其分别与Halomonas sp. Nj223 ectABC基因簇所编码的二氨基丁酸转乙酰基酶(EctA)、二氨基丁酸转氨酶(EctB)和四氢嘧啶合成酶(EctC)的相似性达57%、96%和85%。在线软件预测了ectABC上游可能的启动子序列和位置。利用分子克隆技术将ectB基因亚克隆至表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-ectB,通过限制性酶切和测序分析,目的基因的大小、插入位置和读码框均正确,未发生错配和移码。将重组表达载体pET-ectB转入E. coli BL21(DE3)中,筛选得到阳性重组菌；在IPTG的诱导下,表达产物经SDS-PAGE分析发现,成功表达出一条特异性的46kDa目的蛋白条带。