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鸭疫里默氏菌(RA)可感染鸭、鹅、火鸡等多种禽类,引起一种急性败血性或慢性传染病,常给养鸭业带来巨大的经济损失。为了研究RA的DnaK是否具有分子伴侣的基本特征,以及在热胁迫等应激条件下是否发挥作用,本文进行了一系列的研究,获得如下结果。1、将本实验室分离保存的RA野毒株RA-CH-1株dnaK、dnaJ和grpE全基因序列分别克隆到表达载体pET32a(+)载体中,构建原核表达质粒pET32a (+)dnaK、 pET32a(+)dnaJ和pET32a (+)grpE并将其分别转入大肠杆菌BL21中,成功表达出DnaK、 DnaJ和GrpE重组蛋白,用亲和层析的方法获得纯度较高的重组蛋白。2、用超微量ATP测试盒分别测定纯化的重组蛋白DnaK、DnaJ和GrpE在K+/Na+或Mg2+/Ca2+环境中水解ATP的活性。结果显示,重组蛋白DnaJ和GrpE不具有ATPase活性；而重组蛋白DnaK具有微弱的ATPase活性且DnaJ和GrpE可增强DnaK的ATPase活性,反应温度50℃时DnaK的ATPase活性最高。3、用纯化的DnaK蛋白免疫小鼠制备鼠抗DnaK多克隆抗体,间接ELISA检测血清效价达到1：102400。Western blot检测鼠抗DnaK与RA-CH-1全菌蛋白及纯化的DnaK蛋白的反应性,结果显示该抗体能特异性地识别RA的DnaK蛋白。4、以不同应激条件处理RA-CH-1,提取RNA，荧光定量PCR检测其dnaK的mRNA水平,结果表明,当RA受到热、H202、氨基糖苷类抗生素胁迫及渗透压的作用时,其dnaK的转录水平显著升高；受到酸碱胁迫时,dnaK的mRNA水平无明显变化。5、根据RA的DnaK与大肠杆菌的DnaK氨基酸序列一致性达60%以上,利用λred重组的方法获得缺失了dnaK的大肠杆菌XL1-Blue △dnaK株,同时构建的RA DnaK原核表达载体pBAD24dnaK转化XL1-Blue AdnaK获得缺失回补株,在不同温度的应激条件下测定亲本株E. coliXL1-Blue.缺失株E. coli XL1-Blue △dnaK和缺失回补株E.coliXLl-Blue AdnaK pBAD24dnaK的生长曲线,结果亲本株E. coliXLl-Blue生长良好,缺失株E.coli XL1-Blue AdnaK在42℃时不生长,而回补了RA DnaK的E. coliXL1-Blue AdnaK pBAD24dnaK生长速率得到一定的恢复。表明RADnaK不仅能在一定程度上增强大肠杆菌XL1-Blue△dnaK对温度的耐受,在RA受到各种理化因子的刺激时,可能也扮演非常重要的角色。综上,RA的DnaK蛋白具有ATPase活性,DnaJ和GrpE能有效提高其ATPase的活性,且DnaK在RA抗高温、抗氧化、抗渗透压和抗氨基糖苷类抗生素等应激时具有重要的作用,但在抗酸碱协迫时并不发挥功能；RA DnaK在一定程度上能替代大肠杆菌的DnaK在热休克等应激反应中增强其耐受性。