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Micro RNA(mi RNA)是一种重要的转录后调控的非编码RNA,很多mi RNA在乳腺发育过程中具有重要作用。有研究表明,mi R-221被抑制后,小鼠乳腺上皮细胞数量增加,生长激素受体(GHR)的表达增强。然而,mi R-221对奶牛乳腺发育以及细胞增殖的调控功能与作用机制尚不清楚。因此,本研究通过在奶牛乳腺上皮细胞中过表达和抑制表达mi R-221,利用MTT、流式细胞分析、双荧光报告基因检测以及q RT-PCR等技术,研究mi R-221对奶牛乳腺细胞增殖的影响及其调控机制,获得的结果如下:1.在奶牛乳腺上皮细胞中分别转染mi R-221 mimic、mimic-NC、mi R-inhibitor、inhibitorNC,24 h后进行MTT检测,结果表明,mi R-221 mimic组比对照组能极其显著的抑制细胞活力(P<0.001),而mi R-221 inhibitor能够显著提高细胞活力(P<0.001);进一步通过细胞流式分析发现,与对照组相比,mi R-221 mimic组G2期的细胞数目明显减少,G2+S期的细胞数目与对照组相比减少了13.12%。而抑制mi R-221表达后,G2期细胞数目明显增多。与对照组相比,G2+S期的细胞数目增加了10.57%。以上结果表明:mi R-221具有抑制奶牛乳腺上皮细胞的细胞活力与细胞增殖的功能。2.为了研究mi R-221抑制细胞增殖的分子机理,对其靶基因进行了筛选和鉴定。通过生物信息学软件预测,发现JAK2-STAT5和PI3K-AKT/m TOR信号通路上的m TOR、IRS1、PIK3R1、IGF1、STAT5a、PRLR和AKT3基因3’UTR存在mi R-221的结合位点。将潜在靶基因3’UTR插入到psi CHECK?-2载体,构建双荧光素酶重组载体,分别与mi R-221 mimic和inhibitor及其对照组共转染HEK293T细胞。结果表明,与对照组相比,过表达mi R-221后,m TOR,IRS1,IGF1,STAT5a和PRLR基因的海参酶活性/萤火虫酶活性的比值显著降低(R/F)(P<0.05,P<0.01),而抑制mi R-221的表达后导致IRS1,STAT5a和AKT3基因的R/F值显著增加(P<0.05,P<0.01),表明mi R-221与IRS1和STAT5a基因的3’UTR相互作用。进一步在奶牛乳腺上皮细胞中转染mi R-221 mimic、mimic-NC、inhibitor及inhibitor-NC,通过q RT-PCR发现,过表达mi R-221能够显著抑制IRS1和STAT5a m RNA的表达(P<0.05,P<0.001),而抑制mi R-221的表达能够显著促进IRS1和STAT5a基因的表达(P<0.05,P<0.01)。随后,Western Blot的验证结果与q RT-PCR结果一致。因此mi R-221能够在m RNA和蛋白水平上调控IRS1和STAT5a基因的表达,IRS1和STAT5a基因是mi R-221的靶基因。3.进一步在m RNA水平上探讨了mi R-221对JAK2-STAT5和PI3K-AKT/m TOR信号通路的下游基因PIK3R1、SOCS3、AKT3和m TOR的影响。q RT-PCR结果表明,过表达mi R-221能够显著抑制PIK3R1、SOCS3、AKT3和m TOR的表达(P<0.05);而抑制mi R-221表达后显著促进了SOCS3和m TOR基因的表达(P<0.05)。综上所述,mi R-221通过靶向基因IRS1和STAT5a抑制乳腺上皮细胞增殖的功能,且mi R-221能够影响JAK2-STAT5和PI3K-AKT/m TOR信号通路下游SOCS3和m TOR基因的表达。该研究初探了mi R-221在奶牛乳腺上皮细胞增殖的功能与调控机制,为研究micro RNA对奶牛乳腺发育的调控机制提供理论依据。