论文部分内容阅读
研究背景随着社会人口老龄化,糖尿病发病率逐渐上升,伴随的糖尿病并发症如糖尿病皮肤溃疡、糖尿足的发病人数亦相应地逐渐增加。临床上治疗糖尿病皮肤溃疡或糖尿病足面临着许多困难,因其形成因素复杂,包括糖尿病血管病变致皮肤血运不良、神经感觉功能降低、创面微环境的改变致创面易感染、涉及创面愈合的各种细胞和细胞因子功能减弱等等。因此,研究糖尿病皮肤病变及其创面难愈的确切机制已成为学者们关注的热点和难点。整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)是整合素信号通路的关键激酶,在调节细胞生长、增殖、凋亡、存活、分化、迁移、侵袭和血管生成等方面起着重要作用。目前国内外的研究已证明ILK不仅在维持皮肤的正常结构和形态发育上具有不可缺少的作用,还可通过ILK/AKT/GSK3β传导途径提高成纤维细胞的增殖和抑制细胞凋亡,促进肌成纤维细胞的分化来增强创面的收缩,调控角质形成细胞和毛囊表皮干细胞的增殖、迁移和存活来加速创面的上皮化,从而发挥促进创面愈合的作用。目前,有关ILK与糖尿病的相关性研究主要集中在糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变中,而其在糖尿病皮肤病变和创面愈合中的表达及作用则尚未见报道。故本研究通过建立糖尿病大鼠创面模型,观察ILK及其下游信号AKT/GSK 3β的表达,以探讨整合素信号通路在糖尿病皮肤病变及创面愈合中的作用。第一部分糖尿病动物创面模型的制备目的 制备稳定可靠的糖尿病大鼠创面模型。方法 36只SD大鼠适应性喂养1周后,过夜禁食12h以上,自由饮水。次日糖尿病组大鼠按60mg/kg的剂量一次性腹腔注射浓度为1%的STZ溶液,正常组大鼠注射等量的柠檬酸缓冲液。72h后检测随机血糖,以血糖>16.7mmol/L为确定糖尿病的标准。2周后在其背部切除2cm×2cm大小的全层皮肤建立创面模型。结果 糖尿病组大鼠注射STZ后,出现明显“三多一少”的症状,饮水、食量和尿量增多,体重逐渐下降,伴有毛发稀疏、光泽变暗等,血糖水平升高至28.91±9.33mmol/L;正常组大鼠血糖稳定在6.538±0.62mmol/L,体重逐渐增加。建立大鼠创面模型后,糖尿病大鼠在实验过程中均顺利完成观察和取材,未出现中途死亡。糖尿病大鼠创面愈合缓慢,愈合时间为30.35±2.51天,明显大于正常大鼠的21.47±1.94天。结论 采用腹腔一次注射60mg/kg STZ建立糖尿病大鼠创面模型具有成功率高、稳定性高和死亡率低等优点。第二部分ILK及其下游信号在糖尿病大鼠皮肤组织中的表达目的 通过观察糖尿病大鼠皮肤中ILK及其下游信号的表达,以探讨ILK及其下游信号在糖尿病皮肤病变的作用。方法 实验分为正常大鼠组(N组,18只)和糖尿病大鼠组(DM组,18只)。PCR检测两组大鼠皮肤组织ILK、AKT和GSK-3βm RNA的表达,Western Blot检测ILK、AKT、p-AKT、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白的表达,HE染色切片观察皮肤改变。结果 随着时间的延长,糖尿病大鼠的全层皮肤和表皮厚度逐渐下降。PCR结果显示糖尿病大鼠皮肤中ILK和AKT m RNA表达显著低于正常大鼠(t值分别为4.779和3.4403,P<0.05),而两组大鼠GSK-3βm RNA表达无统计学差异(t=0.363,P>0.05)。Western blot结果显示糖尿病大鼠皮肤中ILK、AKT和p-AKT蛋白的表达均显著低于正常大鼠(t值分别为2.947,6.209和2.63,P<0.05);两组大鼠皮肤的GSK-3β蛋白的表达水平无显著差异(t=0.652,P>0.05),而糖尿病大鼠的p-GSK-3β蛋白表达显著高于正常大鼠(t=4.131,P<0.05)。结论 糖尿病皮肤病变可能与整合素连接激酶及其下游信号的表达变化(ILK/AKT/p-AKT的表达下降)有关。第三部分ILK/p AKT在糖尿病大鼠创面愈合过程中的表达目的 通过观察糖尿病大鼠创面愈合过程中ILK/p AKT的表达,以ILK/p AKT信号通路在糖尿病创面愈合中的作用。方法 实验分为正常大鼠组(N组,18只)18只和糖尿病大鼠组(DM组,18只)。糖尿病大鼠模型成功建立后第2周,于背部切除两个约2cm×2cm大小的全层皮肤缺损创面。在两组大鼠创面愈合过程的第3、7、10、14和21天切取创面组织,Western blot检测创面组织中ILK/p-AKT的表达。创面愈合过程中定期拍照以计算创面愈合速率。结果 在创面愈合过程中,糖尿病大鼠的创面愈合明显慢于正常大鼠,表现为创面收缩减弱和上皮化缓慢;正常大鼠创面组织的ILK表达逐渐升高,而糖尿病大鼠的ILK表达呈现先增加后减少的趋势,但两组大鼠的创面组织与皮肤组织以及各时间点创面组织之间的ILK表达并没有明显的统计学差异。两组大鼠创面组织中p-AKT的表达较正常皮肤明显升高(除外糖尿病大鼠第14天,两组其余时间点的t=4.450~22.566,P<0.01),呈现先增加而后减少的趋势,且正常大鼠各时间点的创面组织p-AKT的表达水平高于糖尿病大鼠(除外第3天,其余时间点t=4.091~20.555,P<0.01或P<0.05)。结论 糖尿病大鼠创面愈合缓慢可能与其创面组织中p-AKT的表达下降有关。