[目的]　　 1.建立一种检测引起婴幼儿急性腹泻常见病毒的多重PCR方法，探讨影响多重PCR扩增的因素。　　 2.将建立的多重检测方法应用于临床婴幼儿腹泻标本，对多重检测方法进行评价，使多重方法能够直接检测并鉴别临床标本中相应的腹泻病毒。　　 3.初步了解深圳地区引起临床婴幼儿急性腹泻的常见病毒的病原分布情况，为临床防治提供依据。　　 4.对引起临床婴幼儿急性腹泻的主要病原-A组轮状病毒进行常见G、P分型分析，为轮状病毒疫苗的研究和开发提供基础资料。　　 [方法]　　 1标本采集与处理　　 收集深圳市第四人民医院2007年8月～2009年2月5岁以下急性非细菌性腹泻婴幼儿的粪便标本413份，其中男性224例，女性189例。标本用生理盐水混匀，制成10％的悬液，于-30℃保存。　　 2引物设计　　 通过查阅文献，在GeneBank中分别找到轮状病毒(Rotavirus，RV)A组、星状病毒(Astrovirus，AstV)、诺如病毒(Norovirus，NV)和肠道腺病毒(Entericadenovirus，EAdV)4种腹泻病毒对应的特异基因序列，分析病毒基因组保守区，根据保守区基因序列，使用Primer5.0和Oligo6.0软件设计、评价PCR扩增引物。　　 3多重PCR方法检测婴幼儿急性腹泻常见病毒　　 优化反应体系，建立RNA腹泻病毒多重PCR筛查体系。阳性产物用测序引物二次扩增，经测序予以确证。　　 4单重PCR法筛查临床腹泻标本EAdV，阳性产物经纯化测序确证。　　 5用巢式PCR法结合测序对A组RV阳性标本进行常见的G、P分型。　　 6统计学分析　　 应用统计软件SPSS13.0对计数资料进行卡方检验(X2 test)或者确切概率法，双侧α=0.05，以P≤0.05为差异有统计学意义。　　 [结果]　　 1、所设计引物Tm值相近，在同一条件下均获得较好的扩增。扩增片段大小有差异，能够用琼脂糖凝胶电泳的方法区分开来，引物均只对预期的片段进行扩增。　　 2、根据实验设计，我们主要探讨了以下几个影响反应的因素，并进行了调整，包括退火温度、缓冲液的浓度、酶、引物的浓度等。通过优化以上条件，各对引物对应的条带可以获得比较均一的扩增。　　 3、在413份标本中，共检出292例至少感染一种腹泻病毒，总检出率为70.70％(292/413)，其中241例为一种病毒感染，51例(12.35％)为混合感染。四种腹泻病毒以RV感染为主，检出率为52.54％(217/413)；其次是NV，检出率为16.95％(70/413)；AstV检出率为7.75％(32/413)；EAdV检出率为6.54％(27/413)。混合感染以RV合并其他病毒感染为主，占88.24％。　　 4、研究发现，RV和NV是引起婴幼儿急性腹泻的主要致病原。RV腹泻发病高峰在10～1月份，高峰期检测阳性率为65.56％。NV腹泻发病高峰除在10～1月份外，在7～9月也有一次高峰。　　 5、实验结果显示，90.07％的腹泻病毒感染患儿年龄在2岁以下，AstV腹泻发病年龄最小，EAdV腹泻年龄最大，RV和NV介于中间。四种病毒均在6～24月龄组发病率最高，以RV发病高峰最明显。　　 6、RV G、P血清型基因分析显示，G1P[8]、G3P[8]、G9P[8]和G2P[4]四种型别是深圳地区A组轮状病毒的主要病毒血清型，占P分型阳性总数的87.13％，其中G3P[8]占50.99％，G1P[8]占32.67％，G2P[4]占1.98％和G9P[8]占1.49％。还检测到其它较少见的血清型，包括G3P[4]，占P型总数的3.96％。另外，混合感染13株，占P型的6.44％。　　 [结论]　　 1实验证明，所建立的多重PCR技术能够一次性检测出婴幼儿腹泻标本中的常见病毒，其敏感性、特异性和可重复性好，为常见腹泻病毒的检测提供了一种方便易行的方法。　　 2 RV及NV是深圳地区婴幼儿急性腹泻的主要病毒病原，混合感染以RV联合其他病毒感染为主，临床上应根据所感染病原体制定有针对性的诊治措施。　　 3 G3P[8]是深圳地区婴幼儿轮状病毒感染性腹泻的主要型别，可为轮状病毒疫苗的研究和开发提供基础资料。