大肠杆菌腺苷脱氨酶的重组表达与应用研究

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近年来的研究发现核苷类似物具有显著的抗肿瘤、抗病毒活性,如齐多夫定(zidovudine)、卡波韦(carbovir)和阿糖胞苷(cytarabine)等已经广泛应用于临床治疗。腺苷脱氨酶(ADA)作为核苷类化合物合成中的一种重要酶是近来研究的热点。本研究构建了含大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的重组菌,以达到高效合成核苷类化合物的目的。   从大肠杆菌K-12中扩增出腺苷脱氨酶基因add,克隆至表达载体pET-28a中,并转化导入大肠杆菌BL21(DE3),构建重组表达菌株PADA。经抗生素实验研究表明,重组菌质粒稳定性高。经过IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE分析,重组菌株PADA能表达大量可溶性酶蛋白。经过酶活性测定,PADA表达的腺苷脱氨酶活性相比对照组大肠杆菌宿主菌株显著提高,比活达到51.07U/mg。通过对酶性质的研究,可知腺苷脱氨酶的最适pH与温度分别为7.5、40C,二价金属离子都会抑制酶活性。在核苷转化反应的测定中,以腺苷(AR)和脱氧腺苷(dAR)为底物时,最高转化率分别达到99.8%和80.9%。而以2’-脱氧-2,6-Z氨基嘌呤(dDAPR)合成2’-脱氧鸟苷(dGR)的反应中,转化率也能达到78%,均远远高于对照组大肠杆菌,同时催化效率也高于野生菌。
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