汉坦病毒(Hantavirus, HV)属于布尼亚病毒科(famly Bunyaviridae),是有包膜的单股分节段负链RNA病毒,基因组由L、M、S三个片段组成,分别编码RNA聚合酶、两种包膜糖蛋白(G1和G2)和核衣壳蛋白(NP)。HV主要引起两种人类急性传染病,即肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)和汉坦病毒心肺综合征(hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS)。其主要临床表现为发热、低血压休克、出血和肾功能衰竭。我国是世界上受HFRS危害最为严重的国家,汉坦病毒属的汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)是我国引起重症HFRS的主要型别。此外,HV还是重要的生物战剂,对未来的军事活动构成严重威胁。尽管自1981年我国成功分离HV以来,国内外学者对HV及其相关疾病的临床救治研究已取得了很大进展,但其发病的分子机理尚未完全阐明,也无特效的治疗药物。因此,探讨HV感染致病的分子机制,寻找有效的抗病毒治疗药物及研制新型疫苗,一直是预防医学和军事医学研究的热点。HV主要感染血管内皮细胞,引起血小板减少、全身小血管和毛细血管广泛损伤及血管内皮细胞肿胀变性等主要病理改变。许多研究证实,HV诱导的免疫反应是内皮细胞功能失调及HV致病的主要环节,但有关免疫网络及众多细胞因子和膜分子在本病发病中的作用及相互关系仍有待深入研究。Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)如同天然免疫的“眼睛”,监视与识别病原体结构成分,启动细胞内信号转导通路,诱导特异性基因表达,分泌细胞因子/趋化因子,这是TLRs活化最重要的效应,也是机体抗感染免疫的第一道屏障。因此,以TLRs为靶位,抑制或激活TLRs表达或调控TLRs信号通路,不仅可以了解机体抗感染免疫的机制,而且还可作为药物设计和疫苗研制的靶点。为了解TLRs介导的抗HV免疫及信号转导机制,本研究选择血管内皮细胞为靶细胞,以TLR4为切入点,应用RNA干扰(RNAi)技术,沉默TLR4基因功能,探讨它对HV的识别及可能的信号转导途径,阐明血管内皮细胞TLR介导的抗HV免疫的分子机制,为HFRS发病机理研究、抗病毒药物设计和疫苗研制提供新的资料。本研究的内容和实验结果如下:1.HTNV感染血管内皮细胞引起Toll样受体变化培养人脐静脉内皮细胞系EVC-304,经HTNV 76-118感染后,用半定量RT-PCR分别测定不同TLRs的表达情况,发现TLR4 mRNA水平上调,而TLR3下调,TLR2、TLR7、TLR9未见明显变化。实验中分别用TLRs的配体刺激作为阳性对照,结果与文献报道相符。既往研究多认为TLR4是一种识别LPS的受体,但近年来的研究发现TLR4也可识别病毒结构成分(病毒蛋白),本研究发现在HTNV感染血管内皮细胞后可引起TLR4表达上调。2.TLR4 siRNA表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立本研究选择Ambion公司的Pol II启动子CMV驱动的P-silencer 4.1-CMV载体。根据GenBank收录的人TLR4(NM-138554)基因序列设计了9条siRNA相对应双链DNA复合体,体外退火连接入siRNA表达载体P-silencer 4.1-CMV,克隆转化后提取质粒。重组载体用Hind III和BamH I酶切后经PAGE电泳分析,得到55 bp大小的条带,初步证实合成片段成功插入载体。DNA序列测定证实所插入的片段序列与合成序列完全一致,表明已成功构建了针对TLR4基因的siRNA表达载体。将9个重组质粒(TS1~9)分别转染EVC-304细胞后,提取mRNA,采用RT-PCR初步筛选出了5种抑制效率较高的质粒,分别命名为TS1、TS4、TS5、TS6、TS8;其中TS4和TS6瞬时转染的抑制效率分别达到89%和90%。将上述5种质粒分别转染EVC-304细胞,用G418筛选,建立了3株可以稳定抑制TLR4表达的细胞系,其中TS4稳定转染的细胞系,其转录水平和蛋白水平的抑制效率均达98%以上。新建细胞系的形态特点及生长周期与原细胞系基本一致。3.病毒感染后细胞因子的分泌变化与TLR4的关系将TLR4表达阳性的细胞系EVC-304和EVC-304 TLR4-分别用HTNV感染72 h后,用ELISA试剂盒检测细胞因子的表达水平。发现IFN-α、IL-8在HTNV感染前后分泌水平未见明显差异, EVC-304和TLR4基因沉默的细胞系EVC-304 TLR4-分泌水平之间也无明显差异; HTNV感染EVC-304细胞后,IFN-β,IL-6和TNF-α分泌增加,特别是加入LPS后增加更为明显,而EVC-304 TLR4-细胞系在病毒感染前后变化不明显,即使HTNV与LPS同时刺激也未见IFN-β,IL-6和TNF-α分泌量发生显著变化。4.HTNV感染血管内皮细胞后引起细胞因子变化的信号转导机制用HTNV 76-118分别感染EVC-304和EVC-304 TLR4-细胞系48 h后,提取mRNA,通过荧光定量PCR检测TLR4下游的关键接头分子MyD88和TRIF的水平。结果显示,EVC-304细胞TRIF转录水平高于EVC-304 TLR4-细胞系,而MyD88转录水平在二种细胞系感染HTNV 76-118后变化不显著。Western blot对MyD88和TRIF的检测结果表明,EVC-304细胞TRIF表达量在感染后高于未感染细胞,而EVC-304 TLR4-细胞系在感染前后未见明显变化。结论:①HTNV感染EVC-304细胞后引起TLR4表达上调,提示HTNV可活化TLR4;②TLR4活化介导了EVC-304细胞IL-6、IFN-β及TNF-α的分泌;③TLR4活化TLR4,引起细胞因子/趋化因子的分泌的信号转导通路可能是MyD88非依赖的TRIF途径。本研究结果证明在HTNV感染后,TLR参与了机体的抗感染免疫和发病过程,对固有免疫的深入研究有助于全面揭示HFRS的发病机制。