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泛素-蛋白酶体系统对于维持细胞中蛋白质的稳态至关重要,蛋白酶体上泛素受体对多聚泛素链的识别是蛋白酶体介导底物降解的第一步,研究泛素受体对泛素链的特异性识别机制有助于我们更好地理解泛素-蛋白酶体系统。泛素受体Rpn13识别K48-泛素链可以促进蛋白酶体对泛素化底物的降解,然而目前只报道了 Rpn13NTD与泛素单体的复合体结构,Rpn13如何特异性地识别K48-泛素链还并不清楚。利用单分子荧光共振能量转移（single molecule fluorescence resonance energy transfer,smFRET）,我们发现 K48-diUb 在溶液中存在3种不同的构象,Rpn13NTD通过构象选择的方式和其中一种构象相结合,对于全长的Rpn13蛋白,以及更长的K48-泛素链来说,结合模式也是一样的。利用液体NMR技术,我们解析了Rpn13NTD和K48-diUb的复合体结构,发现Rpn13NTD同时和K48-diUb的distal亚基和proximal亚基相结合,这与smFRET的结果也是相互印证的。同时,我们发现Rpn13的R104E突变可以显著降低其与K48-泛素链的结合,并导致细胞中泛素化底物的积累,该研究揭示了泛素受体Rpn13和K48-泛素链相互作用的机制,同时也为Proteasome功能调控提供了药物作用的靶点。泛素（Ubiquitin,Ub）是一个小分子信号蛋白,Ub可对其他蛋白进行共价修饰,即泛素化修饰。Ub自身也可被其他物质进行修饰,如磷酸化修饰,在泛素激酶PINK1的作用下,Ub的Ser65位点可发生磷酸化修饰。PINK1是目前已知的且报道最多的的泛素激酶,其通过N端的跨膜区锚定在线粒体的外膜上,经线粒体内膜上的PARL蛋白酶切割可生成可溶形式的PINK1（soluble PINK1,sPINK1）。sPINK1是26 S蛋白酶体的底物,可通过N末端降解途径被泛素-蛋白酶体系统所降解,所以正常细胞中PINK1和sPINK1的水平很低。在某些生理、病理条件下蛋白酶体活性会降低,蛋白酶体活性降低会促进sPINK1水平升高,从而提高细胞中磷酸化泛素（pUb）水平。磷酸化修饰可以调控Ub的三级结构,使之产生一种新的构象——retracted态,同时我们将与野生型Ub相似的构象称之为relaxed态,relaxed和retracted态两种构象的比例会受到pH的调控。PINK1不仅是泛素单体的激酶,同时也是多聚泛素链的激酶,磷酸化修饰是否以及如何影响K48-泛素链结构和功能还不可知,K48-泛素链在细胞中含量最多,主要用于介导蛋白酶体对泛素化底物的降解。K48-diUb是最简单的K48-泛素链,也是泛素受体识别的基本单元。K48-diUb在溶液中存在三种不同的构象,当发生磷酸化修饰后,K48-diUb的每个亚基在溶液中也存在relaxed和retracted两种构象,26S蛋白酶体上三个固有的泛素受体（Rpn1、Rpn10和Rpn13）通过构象选择的方式与K48-diUb的不同构象相结合。通过smFRET滴定,我们发现泛素受体Rpn1、Rpn10与K48-diUb的open态相结合,而Rpn13与K48-diUb的closed态相结合,且构象的偏好性不受泛素磷酸化修饰的影响;通过NMR滴定,我们发现三个泛素受体均优先与磷酸化K48-diUb的relaxed态相结合。此外,我们也发现磷酸化修饰可以改变K48-diUb中亚基的三级结构,并进一步影响其四级结构。磷酸化修饰后会导致与泛素受体Rpn1/Rpn10特异性结合的构象比例显著减少从而抑制Rpn1/Rpn10与K48-diUb的结合,而磷酸化修饰对Rpn13与K48-diUb的结合没有显著的影响。通过TIRF技术从整个蛋白酶水平来研究K48-泛素链和泛素受体的相互作用,我们发现磷酸化修饰可以显著缩短K48-泛素链在蛋白酶体上的停留时间（dwell time）。利用体外降解实验以及体内细胞实验,我们发现磷酸化修饰可以抑制蛋白酶体对泛素化底物的降解。此外,我们也发现sPINK1水平升高能促进细胞中aggregate的形成并导致细胞的死亡增加。综上所述,本论文的研究主要是围绕泛素-蛋白酶体系统、泛素受体特异性识别K48-泛素链,以及磷酸化修饰对K48-泛素链结构和功能的调控来展开的。利用smFRET,我们发现泛素受体Rpn13特异性地与K48-泛素链的闭合态相结合,同时利用液体NMR,我们解析了Rpn13NTD与K48-diUb的复合体结构,阐明了 Rpn13特异性识别K48-泛素链的结构基础;此外,结合NMR和smFRET技术,我们发现磷酸化修饰能够从三级结构、四级结构多层次重塑K48-泛素链的结构,从而影响三个泛素受体对K48-泛素链的结合,通过TIRF方法从蛋白酶体水平我们进一步证实了泛素磷酸化修饰能够抑制蛋白酶体和泛素化底物的结合,并最终影响蛋白酶体对泛素化底物的降解。