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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染猪引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,被世界动物卫生组织列为15种A类法定传染病之一。CSF在全国乃至世界广泛流行且严重危害养猪业。2017年农业部提出需实现在2020年底种猪场猪瘟净化目标。目前我国用于控制CSF疫情的疫苗以弱毒苗为主,不利于CSF净化与防控。因此,研制有利于CSF净化的新型疫苗显得尤为重要。本研究利用基因工程技术,将具有良好免疫原性的CSFV E2基因与4个特异性的线性中和抗原表位TAVSPTTLR串联并克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro中;将构建的重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro-E2(+)进行PCR、双酶切及基因序列测定。结果表明,CSFV E2基因和4个抗原表位TAVSPTTLR成功克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro载体,获得了含有CSFV E2基因和4个抗原表位TAVSPTTLR的慢病毒重组载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro-E2(+)。接着将慢病毒重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro-E2(+)与辅助性质粒PMD2.G、psPAX2共转染包装细胞HEK-293T,转染48 h后,在荧光显微镜中观察转染后的HEK-293T细胞,可见典型的绿色荧光细胞,表明含有目的基因CSFV E2(+)的重组慢病毒HIV-1-CSFV E2(+)包装成功。再用重组慢病毒HIV-1-CSFV E2(+)细胞培养上清液感染BHK-21细胞,对感染的BHK-21细胞连续传5代,每一代细胞均可观察到绿色荧光。再通过RT-PCR方法对发绿色荧光BHK-21细胞进行检测,CSFV E2(+)检测阳性。这表明慢病毒载体携带的CSFV E2(+)基因已成功转导入BHK-21细胞基因组。成功获得了表达CSFV E2(+)基因的重组细胞株BHK-21-CSFV E2(+)。为了筛选高表达CSFV E2(+)蛋白的重组细胞株。通过对重组细胞株BHK-21-CSFV E2(+)荧光强度实时观察,并结合嘌呤霉素抗性对荧光率较高重组细胞株BHK-21-CSFV E2(+)进行筛选,接着对荧光率较高的重组细胞株BHK-21-CSFV E2(+)通过有限稀释法再筛选,获得了11株细胞形态和生长状态良好、荧光强度高的BHK-21-CSFV E2(+)重组单细胞;随后我们通过qRT-PCR、SDS-PAGE和Western-blot的方法对获得的11株BHK-21-CSFV E2(+)重组单细胞进行CSFV E2(+)基因mRNA转录和蛋白表达水平检测。结果显示,这11株BHK-21-CSFV E2(+)重组单细胞对CSFV E2(+)基因的转录水平高低相差5倍,CSFV E2(+)蛋白的表达水平有数倍的差异。为了进一步研究CSFV E2(+)基因在BHK-21-CSFV E2(+)重组单细胞基因组中整合的稳定性,我们选取CSFV E2(+)蛋白表达量最高的BHK-21-CSFV E2(+)重组单细胞,通过RT-PCR方法分别对第5、10、20、30代BHK-21-CSFV E2(+)重组单细胞基因组mRNA转录水平进行检测。结果显示,第5代到第30代BHK-21-CSFV E2(+)重组单细胞均能检出CSFV E2(+)基因的mRNA,表明CSFV E2(+)基因已成功整合到BHK-21-CSFV E2(+)重组细胞基因组中,并得以稳定传代。综上所述,本研究通过构建含CSFV E2(+)基因的慢病毒载体,并与辅助性质粒共转染HEK-293T细胞包装出含CSFV E2(+)基因的HIV-1重组慢病毒HIV-1-CSFV E2(+)。再用重组慢病毒感染BHK-21细胞,最终筛选出1株高表达CSFV E2(+)蛋白的BHK-21-CSFV E2(+)重组单细胞,为CSF新型亚疫苗进一步研制奠定了基础。