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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)等相关疾病的重要病原之一.PCV2的ORF2基因是其主要结构蛋白的编码基因,也是区分PCV1和PCV2的重要区域,其编码蛋白具有良好的抗原性.该研究利用PCR技术扩增出PCV2 GD株ORF2基因进行克隆,构建重组腺病毒,成功实现了ORF2基因在293细胞中的表达.主要内容及结果如下:1.PCV2 GD株的分离根据GenBank中猪圆环病毒1型和2型的序列,设计二对套式PCR引物,对120份疑患断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料提取DNA进行套式PCR扩增,检测到了76份PCV2阳性病料.结果表明PCV2在中国已经广泛流行.取其中4份病料样品研磨后,冻融3次,0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌接种PK15细胞,连续传代.提取细胞培养物中的DNA做PCR鉴定,获得了广东分离株PCV2.2.PCV2 ORF2基因的克隆及其序列分析根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计一对引物,为便于克隆到表达载体上,在引物P1中引入KpnⅠ酶切位点,引物P2中引入HindⅢ酶切位点.用PCR从PCV2细胞培养物中扩增出ORF2基因(702bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经PCR、酶切、测序鉴定,筛选出重组质粒pMD-ORF2.对测序结果用blast软件分析,结果表明所克隆的ORF2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性最高为99.5%,与其它PCV2的ORF2核苷酸序列同源性在92.1%~99.5%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%~99.5%之间.3.PCV2 ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达将重组质粒pMD-ORF2和腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用KpnⅠ和HindⅢ双酶切,经酶切的ORF2基因和穿梭载体pAdTrack-CMV连接后用热激法转化E.coli DH5 α,酶切、测序鉴定.将获得携有PCV2 ORF2基因的重组穿梭载体线性化后与腺病毒基因组骨架载体pAdEasy-1共转染E.coli BJ5183,使之同源重组,经PCR、酶切鉴定后获得重组的腺病毒质粒,最后用Pac Ⅰ酶切线性化,脂质体转染入293细胞,获得含PCV2 ORF2基因的重组腺病毒.经Western blot证明表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性,为PCV2感染的诊断和PCV2疫苗的研制奠定了基础.