论文部分内容阅读
颞下颌关节(Temporomandibular joint,TMJ)强直是指髁突与关节窝粘连导致长期张口困难的疾病,严重影响生活质量。由于其治疗技术难度大,复发率高,仍然是临床医师所面对的一项巨大的挑战。在组织学上它可分为纤维性、纤维-骨性及骨性强直。通常认为,纤维性强直可进一步钙化达到骨性强直。而临床与实验研究表明:纤维性和骨性强直可能并非同一病理学过程,骨性强直只能由纤维-骨性强直转化而来,纤维-骨性强直是骨强直的早期表现或过渡阶段,纤维性和骨性强直的主要区别在于是否存在纤维软骨阶段。动物实验表明足够严重的TMJ创伤方可导致骨性强直,相对轻微的TMJ创伤导致纤维性强直。然而,TMJ创伤程度如何影响关节间隙的组织分化并导致不同结局的机制尚不清楚。我们前期以调节骨愈合的关键信号通路Wnt信号和血管生成为切入点,初步探讨了纤维性与骨性强直相关基因表达差异,结果提示:(1)增强的BMP,Wnt信号促进了骨性强直的发生,(2)关节间隙内增强的血管生成,特别是在早期阶段,促进了骨性强直的形成。最近的研究发现人类TMJ强直的透射带区域中含有多向分化潜能的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),其成骨能力低于下颌骨髓MSCs。我们认为TMJ创伤后关节间隙内组织的分化与MSCs自身的增殖和分化能力密切相关。本研究试图从MSCs角度探讨纤维性和骨性强直的发生机制,并分两部分内容对这个问题进行探讨研究。一:创伤性TMJ强直动物模型构建目的:构建创伤性TMJ纤维性和骨性强直的动物模型,探索强直早期阶段组织学表现。方法:选用12只幼龄健康雄性绵羊作为实验动物,所有绵羊均进行双侧TMJ手术,左侧为纤维性强直诱导侧:髁突骨折+2/3关节盘去除+关节窝纤维带去除。右侧为骨性强直诱导侧:髁突骨折+2/3关节盘去除+关节窝骨质破坏。分别在术后1周、2周、4周、8周处死并取样,每个时间点各处死3只绵羊,通过HE染色进行组织学分析(n=3),术前术后分别进行最大张口度及体重测量记录。结果:1.术后1周、2周绵羊最大张口度和体重与术前相比无明显变化(P>0.05);术后4周、8周绵羊最大张口度较术前明显减小,且体重均有增加(P<0.05)。2.组织学结果显示:术后1周,3只绵羊双侧关节间隙均表现为炎症反应,被大量的肉芽组织、纤维蛋白支架、血肿残留及组织碎片填充。术后2周,3只绵羊纤维性强直诱导侧与骨性强直诱导侧组织学表现出差异,尽管双侧关节间隙均由无软骨的纤维结缔组织所占据,纤维性强直诱导侧的纤维组织更加杂乱粗大,关节间隙仍有血肿残留,而骨性强直诱导侧则无血肿残留。术后4周、8周,6只绵羊骨性强直诱导侧均形成纤维-骨性强直。纤维性强直诱导侧均形成纤维性强直。结论:我们研究表明:通过髁突骨折+2/3关节盘去除+关节窝骨质破坏可成功构建TMJ骨性强直模型;髁突骨折+2/3关节盘去除+关节窝纤维带去除可成功构建TMJ纤维性强直模型。此动物模型稳定可重复,为进一步探索TMJ强直的发病机制提供良好的载体。二:创伤性TMJ纤维性与骨性强直间充质干细胞增殖、分化能力的比较目的:比较创伤性TMJ纤维性和骨性强直形成中MSCs的增殖和体外多向分化能力差异。方法:选择幼年雄性绵羊12只,按实验一方法在左侧TMJ诱导纤维性强直,右侧TMJ诱导骨性强直,分别在术后1周、2周、4周和8周各处死3只绵羊,并获取关节间隙的强直骨痂组织。另外选择3只幼龄雄性绵羊获取正常髁突松质骨组织。采用酶消化法及改良组织贴壁法分离、培养及鉴定不同来源的MSCs并按取材时点对各组MSCs进行增殖和体外分化能力的比较。将纤维性强直骨痂来源的MSCs统称为FA-MSCs(Mesenchymal stem cells derived from fibrous ankylosis),又根据取材时点的不同将术后1、2、4、8周来源的FA-MSCs分别称为FA-MSC-1W组、FA-MSC-2W组、FA-MSC-4W组和FA-MSC-8W组。将骨性强直骨痂来源的MSCs统称为BA-MSCs(Mesenchymal stem cells derived from bony ankylosis),又根据取材时点的不同将术后1、2、4、8周来源的BA-MSCs分别称为BA-MSC-1W组、BA-MSC-2W组、BA-MSC-4W组和BA-MSC-8W组。绵羊正常髁突松质骨来源的MSCs称为NC-MSCs组(Normal condylar bonemarrow mesenchymal stem cells)。不同来源的MSCs共计9组。(1)采用流式细胞仪技术鉴定并检测各组MSCs的表面免疫表型,(2)通过细胞克隆形成率实验以及CCK-8测定生长曲线比较各组MSCs的增殖能力,(3)通过体外诱导成骨、成脂和成软骨实验比较各组MSCs的体外分化能力。结果:1.成功从绵羊髁突松质骨组织、TMJ纤维性和骨性强直骨痂中分离并培养出类似于“成纤维样”的基质细胞,并且在体外可以高度增殖。2.流式细胞仪检测不同来源的各组MSCs均表达CD29、CD44、CD166等MSCs特异性表面抗原,不表达CD31、CD45等造血干细胞表面抗原,免疫荧光结果显示:不同来源的各组MSCs均可在一个细胞上同时表达两种MSCs特异性阳性表面抗原(CD29、CD44)。3.克隆形成率实验结果显示:BA-MSC-1W组和BA-MSC-2W组克隆形成能力倾向于分别高于FA-MSC-1W组和FA-MSC-2W组,但差异无显著性。BA-MSC-4W组和BA-MSC-8W组克隆形成能力分别高于FA-MSC-4W组和FA-MSC-8W组,且均低于NC-MSCs组(P<0.05)。4.CCK-8检测结果显示:从第3天开始BA-MSC-1W组增殖活性高于FA-MSC-1W组(P<0.05)。而BA-MSC-2W组与FA-MSC-2W组、BA-MSC-4W组与FA-MSC-4W组、BA-MSC-8W组与FA-MSC-8W组增殖活性相似(P>0.05)。但从第3天到第7天时FA-MSCs各组和BA-MSCs各组增殖活性明显低于NC-MSCs组(P<0.05)。5.茜素红、油红O、阿利辛蓝染色及免疫组化结果显示:不同来源的各组MSCs均能在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。6.Real-Time PCR检测相关成骨标志性基因(ALP、Runx2、OCN、OSX)的表达量,结果显示:在体外成骨诱导7天时,BA-MSC-1W组ALP、Runx2、OCN、OSX的表达均倾向于高于FA-MSC-1W组,但差异无显著性。BA-MSC-2W组ALP的表达高于FA-MSC-2W组(P<0.05),而BA-MSC-2W组Runx2、OCN、OSX的表达与FA-MSC-2W组相近,无统计学差异。BA-MSC-4W组Runx2的表达高于FA-MSC-4W组(P<0.05)。而BA-MSC-4W组ALP、OCN、OSX的表达与FA-MSC-4W组相近,无统计学差异。BA-MSC-8W组Runx2、OCN和OSX的表达高于FA-MSC-8W(P<0.05),每一个取材点BA-MSCs组和FA-MSCs组成骨相关基因表达均倾向于低于NC-MSCs组,但差异无统计学意义。体外成骨诱导14天时,BA-MSC-1W组、BA-MSC-2W组和BA-MSC-4W组ALP、Runx2、OCN、OSX的表达与FA-MSC-1W组、FA-MSC-2W组和FA-MSC-4W组相近(P>0.05)。BA-MSC-8W组ALP、Runx2、OCN表达高于FA-MSC-8W组(P<0.05)。每一个取材点BA-MSCs组和FA-MSCs组成骨相关基因表达均倾向于低于NC-MSCs组,其中BA-MSC-1W组和BA-MSC-2W组ALP的表达均低于NC-MSCs组,差异有统计学意义。FA-MSC-2W组Runx2的表达低于NC-MSCs组,差异有显著性。7.Real-Time PCR检测相关成脂标志性基因PPARγ表达显示:FA-MSC-1W和FA-MSC-4W组PPARγ表达分别高于BA-MSC-1W组、BA-MSC-4W组和NC-MSCs组(P<0.05),每一个取材时点BA-MSCs组PPARγ表达与NC-MSCs组相近,无统计学差异。8.Real-Time PCR检测相关成软骨标志性基因(COL2A-1、SOX9)表达显示:BA-MSC-1W组和BA-MSC-4W组COL2A-1的表达分别高于FA-MSC-1W和FA-MSC-4W组和NC-MSCs组(P<0.05)。BA-MSC-2W组COL2A-1的表达倾向于高于FA-MSC-2W组(P>0.05)。BA-MSC-8W组、FA-MSC-8W组和NC-MSCs组三组COL2A-1的表达相近,但无统计学差异。BA-MSC-1W组和BA-MSC-4W组SOX9的表达分别高于FA-MSC-1W和FA-MSC-4W组(P<0.05),BA-MSC-2W组和BA-MSC-8W组SOX9的表达分别倾向于高于FA-MSC-2W和FA-MSC-8W组,无统计学差异,每一个取材时点BA-MSCs组和FA-MSCs组均低于NC-MSCs,无统计学差异。结论:1.绵羊创伤性TMJ纤维性和骨性强直骨痂中存在着MSCs,该MSCs可能参与关节间隙的组织分化及强直的进展。2.与创伤性TMJ纤维性强直相比,骨性强直骨痂中的MSCs的增殖、成骨和成软骨能力较强,但成脂能力下降,这表明TMJ创伤后关节间隙组织中MSCs增强的成骨和成软骨能力促进了TMJ骨性强直的发生。3.TMJ创伤术后早期关节间隙内的MSCs分化能力可能与TMJ创伤后的结局相关。