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目的：利用双光子显微镜和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠在体观察细胞活动的优势,以颅脑开窗和离体脑组织切片两种方法考察脑内MI对局部ATP刺激之后的反应,以及应用缝隙连接蛋白抑制剂Carbcnoxalone(CBX)对这一过程的影响来探讨星形胶质细胞是否参与ATP的释放。
利用经典的致炎因子脂多糖(Lipopolysacchiride,LPS)作为MI的外周免疫激活剂,考察LPS腹腔注射24小时后,MI的活化和Cx43的表达变化,同时观察可能与MI急性期活化密切相关的P2Y12受体在腹腔注射LPS后的表达变化。
方法：
1、转基因小鼠在体模型建立:选用6-8w的成年CX3CR1/GFP杂合小鼠作为实验动物,于双光子显微镜下存图。
2、活脑组织切片制备:采用6-8w的成年CX3CR1/GFP杂合小鼠作为实验动物,在ACSF的冰水混合物中快速断头,迅速完整取出大脑组织,于振荡切片机切400um切片后分别置于ACSF或含刺激物的孵育系统中。切片在双光子显微镜下存图或孵育90分钟后多聚甲醛固定备用。
3、在体观察MI突起活动:选用910nm波长,强度在30-40mw之间的激光作为MI存图默认参数,在距离脑表面150um以下的视野作为存图区,在Fluoview300软件系统中存XYT模式动态图像。
4、离体切片共聚焦显微镜存图:选用Cy2激光,在固定激光强度下和固定的FLuoview300软件参数情况下存取XYZ模式图像。
5、Cx43KO小鼠及野生小鼠LPS腹腔注射模型的建立:选用6-8w的KO和WT小鼠,LPS或生理盐水腹腔注射,于24小时后,或4％多聚甲醛灌流固定后取出脑组织,或直接快速取脑冷冻后用于WesternBlot分析。
6、Cx43、GFAP、Ibal免疫荧光染色7、Cx43、IL-1β、P2Y12受体Western blot8、各组间差异的比较应用配对t检验。
结果：
1、颅脑开窗在体观察MI活动:MI的突起时刻向各个方向运动；当局部发生激光损伤时,邻近MI突起的运动方向一致伸向损伤区；局部给予ATP刺激能够模拟激光损伤对MI突起的趋向性；激光损伤对MI突起的趋化作用可以被预先给予的250uMCBX所拮抗;激光损伤前预先给予经典的P2X7受体拮抗剂BBG,不能抑制激光损伤后MI突起的运动。
2、离体活组织切片不同组孵育结果:切片所造成的损伤能够使MI突起向损伤区伸展,CBX能够抑制这种损伤所造成的趋向性,而ATP能够加强这种趋化作用。
3、Cx43在不同组别之间免疫染色和Westernblot分析结果:Cx43在KO-NS组和KO-LPS组均无表达,在WT-NS组有微弱表达,与GFAP共染后可见Cx43与GFAP有部分重叠。在WT-LPS组Cx43表达明显增强。
4、Ibal和GFAP免疫荧光在各组之间比较:在WT-LPS组和KO-LPS组,Ibal和GFAP的表达均较NS两组增强,MI和星形胶质细胞形态活化。
5、P2Y12受体和IL-1β的WesternBlot分析:LPS腹腔注射后脑内P2Y12受体表达增强,WT-LPS组较KO-LPS组表达更强；LPS腹腔注射后脑内IL-1β表达增强,WT-LPS组较KO-LPS组表达更强。
结论：
1、局部ATP刺激能够活化MI。
2、CBX能够抑制激光损伤和ATP刺激对MI的活化。
3、腹腔注射LPS使脑内MI和星形胶质细胞活化,引起脑内炎症因子表达升高。
4、敲除Cx43基因减轻LPS腹腔注射对MI的活化,抑制脑内炎症因子表达。
5、脑内P2Y12受体在腹腔注射LPS后表达增强。
6、Cx43基因敲除能部分抑制脑内P2Y12受体表达。