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目的:从急性敌敌畏中毒并发生惊厥的大鼠和正常大鼠的海马组织中分离并鉴定差异表达的核苷酸序列,为探讨有机磷化合物致中枢神经系统损伤的分子生物学机制奠定基础,并为难治性中枢神经系统损伤的治疗提供线索。 方法:实验采用以PCR反应为基础的抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)分离差异表达基因。体重200-240g的雄性Wistar大鼠20只,随机分为2组,即对照组和实验组。给实验组大鼠皮下注射敌敌畏12.5mg/kg,对照组皮下注射相同容积的生理盐水,在染毒大鼠发生强直痉挛性抽搐20分钟后将所有动物断头活杀,立即取海马组织,分别提取总RNA,分离mRNA,反转录获得cDNA,经RsaⅠ酶切后进行顺向和逆向抑制消减杂交。顺向SSH组:以实验组大鼠海马cDNA作为实验方(tester1),以对照组大鼠海马cDNA作为驱动方(driver1);逆向SSH组:以对照组大鼠海马cDNA作为实验方(tester2),以实验组大鼠海马cDNA作为驱动方(driver2)。实验方cDNA两端接上不同的接头后与驱动方变性退火杂交,杂交产物经PCR扩增后,将扩增产物克隆至T载体,电转化DH5alpha宿主菌,获得顺向和逆向SSH消减cDNA文库。顺向组和逆向组各挑取50个克隆,经酶切鉴定有86个克隆含有差异片段,两组各随机选取8条差异片段做狭缝杂交,将鉴定为大鼠海马组织源性的差异表达片段进行核苷酸序列分析和同源性比较,对有功能线索的基因进行初步的功能研究。 结果:克隆制备成大鼠海马组织急性敌敌畏中毒相关的cDNA文库。筛选出8个有意义的差异表达cDNA片段,进行序列测定,并经BLAST进行同源性比较,发现有3个是已知基因的部分序列,另外5个基因片段是新序列。03号(372bp)片段上调表达,其中362bp与CTCF(11-zinc finger protein)基因的一段有98%的同源性;09号(384bp)片段下调表达,其中346bp与beta-actin基因的一段有99%的同源性;11号(544bp)片段下调表达,483bp与RGS5(regulator of G-protein signaling 5)基因的一段有98%的同源性。 结论:抑制消减杂交技术能够有效分离扩增差异表达的基因,是目前分离新基因的一种重要方法。本实验证实在敌敌畏中毒诱发惊厥的大鼠海马组织中发生了基因调控表达的变化。对所获得已知基因的功能进行文献检索,提示这些基因与细学位论文抑制消减杂交法分离急性敌敌畏中毒大鼠海马组织的差异表达基因胞的生长调控、基因的激活和抑制、染色质隔绝以及神经递质的释放、树突棘的可塑性有关,可能在有机磷化合物致中枢神经系统损伤中起着一定作用。