葡萄（Vitis vinifera L.）在冬季温暖的地区需经历足够的低温完成自然休眠解除,才能正常地开花结果。芽休眠延长是这些地区葡萄栽培的主要障碍。因此,在这些地区必须用人工破眠处理来代替低温的作用,以缩短芽休眠周期,使葡萄花期一致和座果率提高。目前采用的人工解除休眠的有效方法是单氰胺（HC）处理。HC在解除休眠的同时对葡萄树及周围环境具有一定的毒性,因此寻找一种替代HC、无毒并且对葡萄芽休眠解除有良好效果的破眠剂显得尤为重要。研发有效和安全的休眠解除方法,依赖于对现有各种打破芽休眠的刺激引发的复杂信号通路和级联反应的分子机制的充分了解。但是目前对调控葡萄芽休眠解除的分子机制尚不清楚。HC在葡萄芽休眠解除过程中能干扰线粒体中细胞色素通路活性,导致短暂的呼吸和氧化胁迫,表现为活性氧水平的升高、三羧酸循环（TCA）活性降低和ATP生成减少。为了解决这一暂时的能量短缺,交替氧化途径、糖酵解、丙酮酸代谢、无氧呼吸和大量蛋白质降解在休眠芽内被诱导。同时也诱导乙烯（Ethylene）和脱落酸（ABA）之间相互作用,消除ABA的抑制作用,以恢复组织生长。愈来愈多的研究证实乙烯在休眠解除中所起的关键作用,然而,乙烯生物合成和信号途径在调控芽休眠解除方面的潜在作用尚未被探讨。本文利用HC、叠氮化钠（AZ）、低氧（Hypoxia）、乙烯及乙烯抑制剂（NBD）等处理从生理生化指标、基因水平和蛋白水平等不同的角度,筛选并分析对葡萄芽休眠解除有调控作用的乙烯生物合成相关基因、乙烯信号途径成员和乙烯信号下游靶标基因。主要研究结果如下:1.葡萄休眠芽的乙烯浓度从内休眠诱导期过渡到内休眠维持期短暂上升,受HC和AZ处理诱导葡萄（Vitis vinifera cv.Early sweet）单芽茎段体外培养21天萌发率表明,葡萄休眠芽在12月份进入内休眠的深休眠状态。乙烯浓度在葡萄休眠芽从内休眠诱导期过渡到内休眠维持期的时间点（即11月21日）显著提高,随着进入内休眠的深休眠阶段而明显降低。然而,乙烯生物合成的前体——1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的产生与乙烯浓度呈负相关关系。相比于内休眠的诱导期,ACC的合成量在休眠芽的最深休眠阶段约下调20%;从内休眠的深休眠阶段逐渐过渡到休眠萌发阶段时,ACC含量提高1.8倍。此外,与对照相比,休眠芽经AZ处理后,内源乙烯浓度在6、24和48 h分别提高了1.7、15.4和5.3倍;HC处理后,内源乙烯分别提高了2.9、9.5和5.6倍。与对照相比,低氧处理分别在24和48 h下调内源乙烯的浓度2.5和1.4倍。这些结果表明HC和AZ处理都能显著促进葡萄休眠芽内源乙烯的产生,而低氧显著抑制内源乙烯的合成。2.乙烯可作为刺激信号,促进葡萄休眠芽萌发与对照相比,经100 ppm乙烯气体处理12、14、18和21天后,休眠芽的萌发率分别提高了10、5、2和1.3倍。经0.7%乙烯利处理24天后,休眠芽的萌发率也显著地高于对照约2.4倍。在葡萄园中,对休眠期的枝条喷施0.8%乙烯利溶液,休眠芽的萌发率在处理后的42天也显著地高于对照组处理约1.3倍。在阻断乙烯合成与信号处理中发现,与HC处理相比,2%硫代硫酸银（乙烯信号抑制剂）结合HC处理,在14-24天时显著抑制了HC处理的芽萌发率（约为3倍）;而氯化钴（乙烯生物合成抑制剂）的处理完全抑制HC处理对芽内休眠解除。此外,二环庚二烯（乙烯信号抑制剂）也可显著地抑制HC和AZ对内休眠提前解除。终上所述,乙烯可以作为刺激信号促进葡萄芽休眠提前解除,其生物合成对葡萄芽休眠解除的调控至关重要。3.两组不同表达模式的乙烯生物合成相关基因在葡萄休眠芽中特异表达在葡萄休眠芽中特异表达5个ACC合成酶基因（VvACS）和3个ACC氧化酶基因（VvACO）。基于这些基因对HC、AZ、低氧、乙烯和NBD的响应及在自然休眠周期内都表现为两种不同的转录表达模式,因此将这些ACS和ACO基因分为两个亚组:亚组Ⅰ包括VvACS1、VvACS6、VvACO2和VvACO4,亚组Ⅱ包括Vv ACS2、Vv ACS9和VvACO1。亚组Ⅰ基因显著地受HC和AZ处理的诱导表达,但对外源性乙烯和低氧（也是休眠解除刺激）的处理没有显著的响应;亚组Ⅱ基因显著地受HC处理下调表达,但却受乙烯和低氧处理的显著上调表达。在自然休眠解除期间（12月18号至1月8号）,休眠芽中的三个ACO基因的表达均受到抑制。在这期间乙烯生物合成量降低,ACC积累增多。由此认为,在休眠周期中乙烯生物合成的主要调控步骤是由ACC氧化酶调控,而VvACO2可能作为关键因子。4.利用转录组学（RNA-seq）分析响应乙烯信号的芽休眠解除相关的关键基因在人工刺激处理的两个时间点内（24和48 h）,同时受HC、AZ、低氧和乙烯显著性上调并受NBD显著性下调的基因共有180个,参与编码的蛋白包括ABA响应因子结合蛋白3、吲哚-3-乙酸、乙烯受体蛋白、脂氧合酶和茉莉酸氨基合成酶等;与之相反,同时受HC、AZ、低氧和乙烯显著性下调并受NBD显著性上调的基因共有183个,参与编码的蛋白包括9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶4、细胞色素P450单氧酶和12-氧-植物二烯酸还原酶等。此外,在葡萄休眠芽中特异表达的106个乙烯响应转录因子（ERF）基因中,有38个成员显著地响应于乙烯信号,其中,ERF第七家族全部成员（VvERF057、VvERF058和VvERF059）的表达模式与芽休眠解除密切相关。5.在休眠解除过程中,VvERF057的表达依赖于氧气浓度,而VvERF059的表达受乙烯诱导利用农杆菌介导烟草瞬时表达的GFP融合蛋白的定位表明,VvERF057、VvERF058、VvERF059和VvERF031定位于烟草叶片表皮细胞的细胞核中。同时,利用原核表达技术结合镍柱,成功表达和纯化这四个转录因子蛋白。结合qRT-PCR技术和western blot技术分析表明VvERF057在基因和蛋白水平上都受低氧诱导而积累,并在有氧条件下被降解。此外,与KMnO4对照相比,乙烯对VvERF057蛋白积累没有影响。而VvERF059在低氧条件下也有积累,但在恢复有氧条件下没有明显的降解,且在乙烯处理48 h后,VvERF59蛋白含量相比对照增加了1.5倍。综合以上结果表明,VvERF057的基因和蛋白表达均依赖于氧气,而VvERF059的基因和蛋白表达均不依赖于氧气,但受乙烯诱导上调表达。6.葡萄芽休眠解除过程中,HC诱导分生组织细胞壁的胞间连丝（PD）形成开放状态,受乙烯诱导的β-1,3-葡聚糖酶可能参与PD状态的转变相比于对照组呈关闭状态的PD,经HC处理4天时的休眠芽,在两个细胞之间的细胞壁形成了开放状态的PD。结合qRT-PCR技术和western blot技术分析表明β-1,3-葡聚糖酶在HC处理4天时分别在基因水平和蛋白水平上表达最高,该酶的免疫定位表明在HC处理4天后主要分布于小液泡,可能与酶蛋白转运到细胞壁相关。在乙烯处理24和48 h时,其表达量均高于对照。因此,β-1,3-葡聚糖酶可能是一个参与芽休眠解除过程中PD开通的乙烯靶标基因。