论文部分内容阅读
由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PoRV)引起的猪腹泻是严重危害养猪业的急性、高度传染性的肠道疾病。三种病毒常呈混合感染,其发病特点是严重的肠炎、呕吐和水性腹泻,哺乳仔猪死亡率高。能够造成重大经济损失,成为养猪行业的一个重要问题。尽管近年来针对其研制了相应疫苗,但效果并不是十分理想,而且随着病毒毒株的变异,疫苗保护效力愈发不稳定,所以很长一段时间内,猪腹泻类病毒感染仍然是中国养猪业的一个不容忽视的问题。另一方面,由于猪腹泻病毒难分离,传代培养困难,传代病毒含量低等因素的存在,使得传统疫苗的研发仍然面临诸多挑战,因此研究出安全有效且使用便捷的新型疫苗是解决目前问题的方式之一。1.PEDV、TGEV和PoRV三种中和抗原表位基因的克隆及生物信息学分析以本实验室保存的 PEDV-HN13 毒株、TGEV-TZ-10-2016 毒株、PoRV-GD-01-2015毒株为基础,结合近年来对PEDV、TGEV、PoRV三种病毒中和抗原表位的研究进展,其中参照PEDV CV777经典株S基因(登录号:AF353511),TGEV Purdue分离株S基因(登录号:DQ811789.2),PoRVOSU株VP7基因(登录号:KJ450849.1)设计3对引物,通过RT-PCR得到PEDV-COE、TGEV-SA和PoRV-VP7目的基因片段,并克隆至pGEM-TEasy载体,并成功构建重组质粒pGEM-T-COE、pGEM-T-SA、pGEM-T-VP7,并经酶切鉴定和测序比对,结果符合预期。而后利用SnapGene软件对重组杆状病毒表达载体的构建过程进行模拟,并得到串联基因COE-SA-VP7的拼接序列,并对其进行相关生物信息学分析,结果显示其蛋白相对分子量为56.77kDa,并具有良好的免疫原性。2.重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7的构建及鉴定通过酶切将目的基因PEDV-COE、TGEV-SA和PoRV-VP7分别从重组质粒pGEM-T-COE、pGEM-T-SA和pGEM-T-VP7中分离并纯化,按照一定顺序依次连接到杆状病毒载体pFastBacHTA中,最终构建得到重组杆状病毒载体pFastBacHT-VP7,pFastBacHT-SA-VP7和pFastBacHT-COE-SA-VP7,经酶切鉴定和测序比对,结果均符合预期。而后借助Bac-to-Bac系统将重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7转座到DH10Bac感受态细胞中进行胞外重组,经脂质体介导转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7。提取感染重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7细胞的总RNA并进行 RT-PCR 反应,可分别扩增出 PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7 和 COE-SA-VP7 目的基因,表明串联基因成功在细胞内进行转录。经间接免疫荧光试验表明,重组杆状病毒可以被猪源PEDV、TGEV、PoRV单阳性多抗血清所识别,具有一定的反应原性。Western-blot结果表明,目的蛋白能够被His标签抗体所识别,分子量大小约为56.77kDa,结果符合预期。将重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7按照一定的免疫剂量免疫小鼠,在血清中能够检测到相应抗体产生。3.重组杆状病毒载体的优化与鉴定以重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7为基础,通过设计引物借助PCR技术将TAT蛋白转导肽引入串联基因以及将Linker柔性肽引入串联基因两端。将PCR得到的COE-SA-VP7-TAT和L-COE-SA-VP7-L 目的基因片段引入杆状病毒载体pFastBacHTA中,构建得到重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7-TAT和pFastBacHT-L-COE-SA-VP7-L,而后将两者通过Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统转染至Sf9细胞中,获得重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7-TAT和rBac-L-COE-SA-VP7-L,提取感染重组杆状病毒细胞的总RNA并进行RT-PCR反应,均可分别扩增出符合预期大小的目的基因片段,表明串联基因成功在细胞内进行转录。经间接免疫荧光试验表明,重组杆状病毒可以被猪源PEDV、TGEV、PoRV单阳性多抗血清所识别,具有一定的反应原性。