前言角膜上皮的一个重要生理功能就是对外界生物和化学损伤起屏障作用。角膜上皮细胞层为复层上皮，细胞分为3种：基底细胞；翼状细胞；表层细胞。表层细胞之间的紧密连接与细胞膜一起构成有效防线阻止液体和其他化学物质进入角膜深层，使眼免受病原微生物及各种物理化学因素变化的影响，同时也防止泪液及其化学成分的渗透。紧密连接是细胞与细胞之间的连接在调节旁细胞通路的通透性上起至关重要的作用。它使相邻细胞两层质膜紧紧靠在一起，中间没有空隙，粘着牢固。同时还限制细胞顶侧的脂质成分和基侧的膜蛋白质成分的流动，在产生和维持细胞极性方面也起到重要作用。紧密连接主要由跨膜蛋白和胞质附着蛋白两种成分组成，同时细胞骨架(主要是微丝)也参与紧密连接的组成。目前发现的跨膜蛋白有三种：闭合蛋白(claudin)，咬合蛋白(Occludin)和连接粘附分子(junctional adhesion molecules，JAM)。1998年Martin-Padura等发现一种存在于内皮细胞、上皮细胞连接中的分子，并通过CHO转染证实其在细胞连接中起重要作用，因此命名为连接粘附分子(JAM)。目前被称为JAM-A或JAM-1。连接粘附分子属于免疫球蛋白超家族有三个成员，JAM-1、JAM-2、JAM-3。JAM-1，30-40×10~3Da，有两个特征性细胞外的Ig样的蛋白域，远膜端V-型，近膜端C-型Ig样域，一个跨膜区和细胞内短尾。在C末端有一个Ⅱ型PDZ结合域能与含PDZ的分子相结合参与紧密连接的构成。PDZ是蛋白质之间结合的模块，识别与它相结合的蛋白质的C-末端。含PDZ域的蛋白质多是骨架蛋白，与其他蛋白质结合形成质膜下大的蛋白质复合结构，参与紧密连接的构成。同时JAM-1还参与紧密联结创伤后的再修复及上皮屏障功能的调解。但JAM-1不仅表达在能够形成细胞连接的上皮、内皮细胞，同时存在于血小板和免疫系统的细胞中，如鼠的血小板和淋巴系统中表达MHCⅡ型抗原的细胞中，在人类则表达在循环的红细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板表面。实验证明它在多种细胞活动中发挥作用，包括参与紧密连接的构成、白细胞游走、血小板活化、新生血管形成及与病毒结合等。但JAM-1是否存在于人的角膜细胞连接中，尚未见报道。咬合蛋白(Occludin)是最早发现的与紧密连接相关的跨膜蛋白，参与紧密连接功能的调节，并且在角膜上皮细胞表达。本实验旨在检测JAM-1在正常与病理情况下人角膜各层中的表达；并与咬合蛋白分布特点相比较。材料与方法1、标本来源正常角膜来源于北京医科大学第三临床学院眼科中心眼库及日本顺天堂大学医学部眼库。病变角膜来源于北京医科大学第三临床学院眼科中心2005年5月-2007年2月、中国医科大学附属盛京医院2006年3月-2007年1月及日本顺天堂大学医学部眼科2005年4月-2006年3月角膜移植或眼球摘除手术切除的角膜组织。2、细胞培养及RT-PCR人角膜上皮细胞(Human corneal epithelial cells，HCEC)、基质细胞、内皮细胞培养至细胞融合。弃上清，加入Trizol试剂提取细胞RNA。以逆转录后获得的cDNA为模板，PCR扩增目的基因。PCR反应：总体积20μL，模板cDNA1μL。反应条件为：94℃5min→94℃60s，54～60℃30～60s，72℃60s 30循环→72℃10min，4℃。凝胶电泳检测：PCR产物各取8μl，加2μl10X缓冲液，混合后上样，1.5％琼脂糖凝胶，0.5XTBE，100V电泳40min，EB染色，紫外灯下观察结果，拍照。3、流式细胞仪检测JAM-1蛋白表达取培养细胞1×10~6个溶于100μL PBS中，制成细胞悬液，加入1μg鼠抗人JAM-1单克隆抗体，冰浴30 min，离心弃上清，PBS洗涤2次，加入10％人血清，冰浴15min，PBS洗涤2次，然后加入FITC标记的抗鼠IgG，冰浴30 min，洗涤2次。采用流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson)进行检测分析。4、双重免疫荧光取新鲜正常人角膜材料或手术切除的病变角膜，OCT包埋，冷冻。切取4μm厚冰冻切片，室温干燥1h，丙酮固定10min，无血清Protein Block封闭10min。加鼠抗人JAM-1单克隆抗体(1：300)，室温孵育1h，PBS振洗3次；加FITC标记羊抗鼠第二抗体(1：500)，室温孵育40分钟，PBS振洗三次。再加兔多克隆抗哦ccludin抗体(1：300，室温，1小时)孵育，PBS振洗3次；加入Cy3标记羊抗兔第二抗体(1：500，室温，40分钟)，PBS振洗3次，封片。荧光显微镜观察，拍照。结果1、RT-PCR提取培养角膜细胞总RNA后，通过RT-PCR在上皮细胞及内皮细胞中检测到与JAM-1相一致的581bp长度的扩增片段和与哦ccludin相一致的136 bp长度的基因扩增片段，而原代培养基质细胞中没有检测到相应片断，在培养液中添加20％FCS培养的基质细胞在传代的过程中，CD34、keratocan表达减弱，而α-SMA逐渐增强，同时JAM-1与哦ccludin逐渐表达，在第二代可检测到JAM-1表达，在第三代培养细胞中检测到JAM-1及occludin的表达。2、流式细胞仪检测JAM-1蛋白表达取培养人角膜细胞，经鼠抗人JAM-1单克隆IgG抗体和FITC标记的抗鼠IgG染色后，经流式细胞仪分析，结果显示：人培养角膜上皮细胞、内皮细胞及第三代培养角膜基质细胞均表达JAM-1蛋白，原代培养角膜基质细胞无表达。3、双重免疫荧光检测JAM-1和Occludin表达新鲜人角膜经JAM-1、occludin抗体染色后，显微镜下可见occludin染色主要位于表层上皮层细胞之间，在基底细胞之间仅见胞质的背景荧光染色。而JAM-1荧光染色不仅见于上皮浅层，在整个上皮层细胞之间均可见荧光反应，清晰地勾画出细胞的轮廓。在融合图中可见橙黄色融合荧光位于角膜浅层，在角膜深层仅见绿色的JAM-1的荧光染色。在角膜基质内可见对JAM-1、occludin的弱荧光反应，位于胞质内，红色、绿色荧光分布一致。内皮为一层扁平细胞，荧光显微镜下可见JAM-1与ccludin相似的荧光着色。在胶滴样角膜营养不良中，JAM-1重新分布于角膜上皮细胞的表层及上皮基底细胞深层，而在中央区消失。在溃疡修复的角膜，在溃疡的边缘仅见JAM-1勾画出细胞轮廓，在近周边部可见到JAM-1与occludin的共分布。在炎症性角膜病变中角膜基质细胞中，可见JAM-1的强荧光染色。在圆锥角膜中JAM-1分布与正常角膜相似，但上皮细胞层薄厚不均，细胞大小不一。结论1培养角膜人上皮细胞表达JAM-1，培养人角膜内皮细胞表达JAM-12培养液中添加1％FCS原代培养角膜基质细胞不表达JAM-13角膜基质细胞培养过程中，培养液中添加20％FCS，能够诱导基质细胞活化为成纤维细胞、纤维母细胞。基质细胞在转化为成纤维母细胞的过程中，JAM-1、occludin逐渐表达且JAM-1早于occludin，提示它可能以某种方式参与角膜创伤的修复。4在正常人角膜JAM-1除了在紧密连接存在的角膜表层细胞间表达与occludin相一致外，同时还在角膜翼状细胞和基底细胞之间表达，提示JAM-1除参与角膜紧密连接的构成和调节外还参与其他功能。5在病变角膜中JAM-1分布重新分布，基质细胞表达JAM-1，在角膜溃疡修复中JAM-1先于occludin出现在溃疡边缘。作为免疫球蛋白家族成员JAM-1在创伤修复的早期出现，提示它可能参与角膜创伤修复信号传导的启动，参与修复的调节。