肝脏作为机体的最大的代谢器官,承担着体内新陈代谢,排毒,免疫功能和主要营养物质及胆汁分泌的功能,它在疾病的发展和进程中起着极其重要的作用。在当前的畜禽养殖过程中,由于滥用抗生素及霉菌毒素的现象广泛存在,导致给肝脏带来了比较大的负担,因此由肝损伤引发的疾病变得日益严重。如果肝损伤不能得到及时的治疗或有效的预防,将给畜禽产业带来非常大的损失。此外,每年约有200多万人患有肝病,还有100万人患肝硬化,病毒性肝炎和肝细胞癌等等并发症。肝病是由多种要素引起的,包含基因、病毒、酒精、肥胖症和内毒素。内毒素血症是临床实践中多器官衰竭的常见缘由。内毒素血症引起的肝损伤发生在多器官衰竭综合征的早期,并且与预后不良有关。脂多糖（LPS）诱发的肝损伤是大多研究者研究肝损伤的机制和治疗研究选择的常用模型。肝损伤的治疗方法是非甾体类抗炎药,例如水杨酸酯、丙酸、奥昔康和贝芬酸;然而,据报道这些药物会引起肾毒性和胃肠道问题及其他副作用。本试验旨在探究蛋白质酪氨酸激酶抑制剂（Tyrphostin AG528）介导急性期反应蛋白（Orm2）保护脂多糖（LPS）引起肝损伤的作用机制。主要分为3个部分:（1）在体离体两方面分析Tyrphostin AG528缓解脂多糖（LPS）引起肝损伤的作用通路以及对Orm2的诱导表达;（2）探究Orm2对LPS引起肝损伤的保护作用;（3）研究Orm2启动子区转录因子调控的情况。本试验的研究结果为治疗肝脏炎症以及肝损伤提供潜在的治疗靶点。试验一Tyrphostin AG528缓解脂多糖（LPS）引起的小鼠肝损伤本试验中,将21只8周龄大小的雄性C57BL/6小鼠随机的划分为3组（n=7）:对照组（Control）、LPS处理组（LPS）、Tyrphostin AG528治疗组（Tyrphostin AG528→LPS）。LPS处理组给予0.5 mg/kg LPS腹腔注射;Tyrphostin AG528治疗组提前三天,每天一次Tyrphostin AG528腹腔注射15 mg/kg,第三天注射结束后5小时给予LPS处理,3小时后采集血清、肝脏分别提取RNA和蛋白以及多聚甲醛固定肝脏进行HE染色。HE染色结果显示,Tyrphostin AG528治疗组能够显著降低由LPS引起的炎性细胞的浸润;Tyrphostin AG528治疗组的血清AST、ALT水平相比较LPS组极显著下降（P<0.01）;肝脏细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和Mcp-1的m RNA水平在Tyrphostin AG528治疗组显著下降（P<0.05）;Tyrphostin AG528治疗组能够显著抑制AKT和mTOR的磷酸化,并激活STAT1的表达;Tyrphostin AG528治疗组NF-κB信号通路被显著抑制;此外,RNA和蛋白水平一致地显示Tyrphostin AG528的添加促进Orm2基因表达。试验一结果表明,Tyrphostin AG528通过抑制AKT/mTOR信号通路缓解脂多糖（LPS）引起的肝脏细胞因子的升高和炎性细胞浸润,进而保护由LPS引起的肝损伤;另外Orm2在Tyrphostin AG528治疗组的升高提示着其可能参与肝损伤的修复。基于在体试验结果,我们采用2.5μM浓度的Tyrphostin AG528处理人正常肝细胞LO2细胞24小时后,LPS以500 ng/ml刺激2小时后提取细胞总蛋白。Tyrphostin AG528治疗组能够显著抑制AKT和mTOR的磷酸化（P<0.05）,此外,Orm2的蛋白表达在Tyrphostin AG528治疗组显著升高（P<0.05）,这与在体结果一致。进一步地提示我们Orm2可能参与肝损伤的修复。试验二Orm2重组蛋白对LPS引起小鼠肝损伤的保护作用机制研究在试验一的基础上,为了研究Orm2是否直接参与LPS引起的肝损伤,以及发挥怎样的功能。我们设计了如下试验:将28只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为4组（n=7）:对照组（Control）、Orm2单纯添加组（Orm2）、LPS处理组（LPS）、Orm2治疗组（Orm2→LPS）,Orm2治疗组腹腔注射Orm2重组蛋白2.7μg,30分钟后腹腔注射LPS,3小时后采集血清、肝脏分别提取RNA和蛋白以及多聚甲醛固定肝脏HE染色。HE结果的染色显示Orm2治疗组可以明显降低由LPS引发的炎性细胞的浸润;Orm2治疗组的血清AST、ALT水平相比较LPS组极显著下降（P<0.01）;肝脏细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的m RNA表达在Orm2治疗组明显下降（P<0.05）;由LPS引起CCL4的RNA水平升高被Orm2治疗而显著抑制（P<0.05）;此外,Western blotting结果显示Orm2的治疗并不能影响肝脏的CCR5蛋白表达,而使得Orm2蛋白水平升高;Orm2治疗组NF-κB信号通路被明显抑制。试验二的结果表明,Orm2重组蛋白通过与CCL4竞争性结合CCR5从而改善由LPS引起的肝损伤。试验三探究LO2细胞中Orm2启动子区转录因子的调控情况基于试验一中Tyrphostin AG528可以激活STAT1的磷酸化蛋白表达的现象,为了研究Orm2上游调控情况,我们通过预测Orm2启动子区的转录因子结合情况,发现STAT1在Orm2启动子区存在多个结合位点。通过小干扰RNA在LO2细胞敲降STAT1,48 h后蛋白质免疫印迹显示Orm2的表达也随之发生下降（P<0.05）;构建STAT1的表达质粒,过表达STAT1后,48 h后Orm2的蛋白程度明显上升（P<0.05）。随后,我们构建了Orm2启动子区表达质粒以及STAT1表达质粒,进一步的,STAT1与Orm2启动子区质粒共转染LO2细胞,能够显著激活promoter～1102 bp与promoter～1570 bp启动子区的荧光素酶活性（P<0.05）,这部分结果表明STAT1通过调控Orm2启动子区的活性从而调控Orm2的表达。综上所述,我们发现了一种缓解肝损伤的新靶点——小分子化合物Tyrphostin AG528一方面抑制AKT/mTOR信号通路从而减轻脂多糖诱导的肝脏炎症,另一方面通过激活急性期反应蛋白Orm2的表达,保护机体免受外界应激的伤害。这一研究结果为治疗肝脏炎症以及肝损伤提供潜在的治疗靶点。