胃癌(Gastric Cancer,GC)是消化系统最常见的恶性肿瘤,死亡率位居中国恶性肿瘤第二位。研究表明早期胃癌可获得根治性切除,预后较好,五年生存率可达90%,但胃癌的早期检出率不足10%,处于胃癌进展期患者,其五年生存率不足30%,目前仍缺乏有效的非侵入性的早期胃癌筛查的诊断方法。胃癌的发生发展是幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hpylori)感染、环境和遗传等多因素参与的过程,除Hpylori感染、吸烟、饮酒及高盐饮食等目前已确认的危险因素外,单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)和长链非编码RNAs(Long non-coding RNA,lncRNAs)在胃癌中的广泛作用正逐步被披露。由于胃癌的复杂性与异质性,确定其潜在危险因素并通过模型进行风险预测已在高危人群的早期识别、精准预防以及个体化干预中广泛应用。然而,目前现有的风险预测模型中,未见将lncRNAs作为风险因子纳入评估,且在胃癌领域未见基于多基因风险评分(Polygenic risk scores,PRS)构建的风险预测模型。目的通过定量系统评价和Meta分析明确Hpylori感染、环境等非遗传因素和遗传因素对中国人群胃癌发生的影响及其流行病学意义:基于人群验证关联结果,构建胃癌风险预测模型,通过评价各模型间的预测能力,筛选出最优模型,为中国人群胃癌的早期诊断和精准预防提供可能的依据。方法1.遗传和非遗传因素与胃癌发病风险的流行病学评价(1)利用 PubMed、EMBASE、Cochrane Library、Web of Science、CNKI、Wanfang、VIP和CBM数据库进行系统文献检索,对在中国人群中实施并探讨生物、行为、环境和遗传因素与胃癌发病相关的研究进行定量合并分析,并采用Venice标准对积累证据进行质量评价。(2)利用比值比(Odds ratio,OR)及 95%置信区间(95%Confidence Interval,95%CI)分析非遗传和遗传因素与胃癌发病关联强度,假阳性报告概率(False positive reporting probability,FPRP)评估显著性关联结果,并对关联显著的非遗传和遗传因素组合对胃癌发病风险贡献分别进行评价。(3)采用遗传分数(Genetic score)、归因危险度(Attributable risk percentage,ARP)、人群归因危险度(Population attributable risk percentage,PARP)进行流行病学效应评价。2.基于多基因风险评分的胃癌风险预测模型构建(1)利用生物信息学方法筛选出胃癌中存在差异表达并与microRNAs(miRNAs)具有潜在结合位点的lncRNAs及其对应功能性SNPs;根据循证医学(Evidence based medicine,EBM)策略筛选出具有遗传关联的SNPs,并结合已发表的相关领域性系统综述中中国人群相关联位点,对数据进行质控后纳入人群验证。(2)采用1:1频数匹配的病例-对照研究设计,按性别和年龄(±2岁)进行个体匹配,收集660例经病理学确诊的胃癌患者和660例社区正常对照人群血液样本。分别采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)、创造性酶切位点原理结合 PCR-RFLP 方法(Created restriction site-PCR-RFLP,CRS-PCR-RFLP)和荧光多重酶连接反应(Improved multiplex ligation detection reaction,iMLDRTM)对lncRNA SNPs和EBM筛选SNPs进行基因分型。(3)采用拟合优度卡方检验(Chi square test of goodness of fit)评估对照人群的基因型分布是否符合哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE),使用非条件Logistic回归完成两部分SNPs与胃癌发病风险的关联性分析。(4)利用Plink进行关联性SNPs的数据质控、等位基因的关联分析及PRSice-2(Polygenic risk score software)基础数据集(Base dataset)和目标数据集(Target dataset)的生成;基于加权遗传风险评分(Weighted genetic risk scores,wGRS)和PRS,利用经EBM筛选关联验证后SNPs分别构建风险预测模型,将lncRNA SNPs作为危险因素的独立数据集纳入风险预测模型,并使用Empirical P-value进行模型内10,000次拟合以优化参数,构建最优模型。(5)利用受试者工作曲线(Receiver operating characteristic,ROC)及曲线下面积(Areaunder curve,AUC)评价不同模型对胃癌的识别度;采用净重新分类指数(Net reclassification improvament,NRI)和整体鉴别指数(Integrated discrimination improvement,IDI)评估wGRS和PRS模型的预测能力;利用赤池信息准则(Akaike information criterion,AIC)和贝叶斯信息准则(Bayesian information criterion,BIC)评价模型的拟合程度。结果1.H.pylori感染、吸烟、饮酒、家族史、胃部疾病、高盐饮食、腌制食品、快速进食、不规律饮食、食用烫食、烟熏煎炸、辛辣饮食、精神抑郁和糖尿病与胃癌发病相关性分析结果具有统计学意义(P<0.01),Hpylori感染率与胃癌发病率趋势基本一致。2.PSCA rs2976392、rs2294008,MUC1 rs4072037,MTHFR rs1801133,COX-2 rs20417,XRCC1 rs 1799782,rs25487,XRCC3 rs861539,NAT2 rs1799930、rs1799929,NAT2 Phenotype(Slow/Fast)、PLCE1 rs2274223、rs3765524,GSTM1,GSTT1,IL-17A rs2275913、rs8193036,PRKAA1 rs13361707,ERCC5 rs751402,TGFBR rs3773651,IL-10rs1800896 和VDR rs731236 与胃癌发生相关性分析结果具有统计学意义(P<0.05)。3.胃癌非遗传因素与遗传因素组合分布风险的累积频率分别与合并OR值及遗传分数高度相关,经对数变换后,累积频率对应的OR值和遗传分数均符合正态分布;对于非遗传因素,ARP的前三位分别为胃部疾病(66.33%)、腌制食品(54.34%)和烟熏煎炸(49.75%);PARP前三位分别为腌制食品(33.85%)、食用烫食(24.73%)和H.pylori感染(23.30%)。对于胃癌相关联的SNPs,ARP前三位的分别为NAT2,rs1799929(53.91%)、NAT2表型(53.05%)和1L-10 rs1800896(42.85%);对于PARP前三位的分别为 VDR rs731236(36.96%)、TGFBR2 rs3773651(25.58%)和 MUC1 rs4072037(20.56%)。4.基于等位基因、突变杂合、突变纯合、显性和隐性五种遗传模型,根据性别、年龄、吸烟、饮酒和胃癌家族史调整进行多因素logistic回归分析,结果显示,在 21 个胃癌相关 lncRNA SNPs 中,14 个 SNPs(rs1859168、rs4784659、rs579501、rs77628730、rs7816475、rs6470502、rs1518338、rs2867837、rs12494960、rs7818137、rs3825071、rs7943779、rs911157 和 rs16981280)与胃癌发病风险关联具有统计学意义(P<0.05);EBM筛选并验证后的20个SNPs与胃癌发病风险相关性分析表明,15 个 SNPs(rs2294008、rs25487、rs751402、rs1801133、rs1799782、rs763780、rs8193036、rs4072037、rs2274223、rs2275913、rs20417、rs13361707、rs3773651、rs1799930和GSTM1)与胃癌发病风险具有统计学关联(P<0.05)。5.对lncRNA SNPs和EBM筛选SNPs在病例组与对照组中的分布分别进行wGRS,其病例组的wGRS均值均高于对照组。对两种来源的SNPs,根据wGRS评分分布进行分组,以0-1分组人群为参照,随着分数组的增加,胃癌发病风险显著增加,PRS与wGRS分布及分组比较结果趋势一致。6.将EBM筛选并经关联验证SNPs的PRS分为十分位,以40-60%分位为参照,结果表明,随着分位的降低,个体发病风险总体呈下降趋势;随着分位增高,胃癌发病风险呈显著的增加趋势;其中,处于最低10%的十分位风险评分的个体发病风险比一般人群低47%(OR=0.53,95%CI:0.34,0.83);PRS处于最高10%的十分位个体胃癌发生风险是一般人群的3.24倍(OR=3.24,95%CI:2.07,5.06)。7.利用NRI和IDI,对增加一种或多种新的危险因素后模型的预测效果改善情况进行评估,结果显示,在同种因素或条件下,PRS模型均优于wGRS模型且胃癌相关lncRNA SNPs作为独立数据集可有效提高模型的识别度。根据纳入不同危险因素构建模型的ROC曲线,结合不同因素对wGRS和PRS模型的AIC和BIC影响的比较,筛选出拟合优度最佳者。结果显示,在PRS基础上引入lncRNA SNPs、吸烟、饮酒及H.pylori感染具有最佳的拟合优度和预测能力(AUC:0.78(0.68,0.88),AIC=117.23,BIC=122.31)。结论1.胃癌非遗传因素与遗传因素组合分布的累积频率和其发病风险均具有明显的线性关系,随人群累积频率的减小,胃癌发病风险显著增加。2.H.pylori感染、腌制食品和食用烫食,VDR rs731236、TGFBR2 rs3773651和MUC1 rs4072037在人群中的暴露对胃癌的发生贡献较大。3.胃癌关联性SNPs与其lncRNA SNPs存在显著的联合作用,在同种因素或条件下,PRS模型优于wGRS模型且引入胃癌相关lncRNA SNPs可显著提高模型的识别度。4.PRS联合lncRNA SNPs、吸烟、饮酒及H.pylori感染的模型对胃癌发病风险具有最优预测能力,有助于区分胃癌高风险和低风险人群。