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碱性脱氧核糖核酸酶(alkaline deoxyribonuclease,AN)由HSV-1的ul12基因编码,在碱性条件下同时拥有核酸外切酶活性和核酸内切酶活性,理论分子量为68.3kD,AN是HSV-1的复制关键酶。对细胞感染UL12无效突变体的子代病毒产量的分析表明了UL12在衣壳化之前参与识别HSV-1复制中间体分支结构,这些发现表明AN能成为抗疱疹病毒的一种新靶点。前期我们克隆了HSV-1 SM44株(来自中国生物制品检验所)的ul12基因,构建了原核重组表达质粒pET32a-UL12,表达产物AN在大肠杆菌BL21中以包涵体形式存在,对其进行溶解、复性和活性检测,虽然得到有核酸酶活性的蛋白,但复性困难和蛋白收率降低,不利于AN的大规模制备,使AN的进一步应用受到了限制。目的用毕赤酵母系统表达AN,以便得到足量、可溶的活性蛋白AN。方法1.目的基因ul12-2的合成:NCBI上查阅目的基因ul12-2 HSV-1国际标准株17株的序列,在不改变其氨基酸序列的前提下,利用软件对密码子进行优化,选择毕赤酵母表达偏好的密码子,设计一条新的基因序列ul12-2,在基因两端分别引入酶切位点EcoR I和Not I,同时加入含6个组氨酸的His-tag,基因全长1913bp,由上海瑞楚生物科技有限公司合成。2.真核表达载体pPIC9K-UL12-2的构建:将ul12-2基因序列经EcoR I和Not I双酶切后,与同样经过EcoR I和Not I双酶切的酵母表达载体pPIC9K进行连接,转化DH5α,提取质粒pPIC9K-UL12-2。3.筛选毕赤酵母pPIC9K-UL12-2重组子:参照文献[1]利用Sal I酶对重组质粒pPIC9K-UL12-2进行线性化,然后电转化整合入毕赤酵母菌GS115,在组氨酸缺陷平板上筛选转化子。通过G418抗性筛选及分析表型得到最利于外源基因表达的重组子。4.在摇瓶上诱导表达an:对筛选出的重组子分别在锥形瓶里诱导表达。诱导方法参照文献[2]做了改进,挑取单菌落接种至10mlbmgy培养基中,于28℃,250-300r/min振荡培养过夜至od600为6左右;室温1500g/min离心收集菌体,用bmmy培养基重悬菌体,使od600在15-60之间,将菌液移入新的摇瓶继续振荡培养;每12h向培养基中补充一次甲醇至终浓度为0.5%,间隔24h取样一次,离心收集上清液,表达产物采用sds-page进行检测。5.an的纯化:依据前期sds-page电泳检测的结果,考虑将诱导上清进行阳离子交换层析和阴离子交换层析两步纯化后再行分析。6.纯化后an的活性检测:按本课题组前期的an活性检测方法[3],参考joelc.bronstein等[4]的酶活性检测方案加以改进,通过an对线性化puc19的降解程度来检测an的核酸外切酶活性。结果1.对合成的ul12序列做核苷酸测序检测。结果显示合成的序列中含hsv-117株的ul12基因,与我们设计的一致。2.构建了真核表达载体ppic9k-ul12-2,对其进行双酶切后发现经ecori/noti双酶切可分别得到约1.9kb和9.3kb的片段,其中1.9kb片段为我们的目的片断ul12-2,同时对重组载体进行了测序鉴定,证明构建成功。3.重组载体ppic9k-ul12-2转化毕赤酵母,得到了40个转化子,所有转化子经pcr鉴定,筛选出8个阳性重组子。对这8个菌株在mm和md培养基上鉴定其表型,结果均为his+/mut+。4.对不同时间段的诱导上清液分别进行sds-page检测,结果表明在约68.3kd处有目的条带显示,但同时有多条杂带存在。5.采用强阳离子交换层析(sp柱)和强阴离子交换层析(q柱)对诱导上清液an进行分离纯化。经sds-page检测经过这二次离子交换层析纯化后的an基本能看见单一条带。6.在采用经过二次离子交换层析纯化的an与线形化的puc19做酶切反应时,线性片段被完全水解,这说明an具有核酸外切酶活性。结论构建了重组质粒pPIC9K-UL12-2,筛选到能表达目的蛋白的高抗性阳性重组子,说明毕赤酵母成功表达了具有核酸外切酶活性的碱性核酸酶AN,这为AN的大量制备与抗HSV-1新药的研发奠定了基础。