【摘 要】
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耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）广泛存在于不同香型的白酒发酵体系中,是发酵中后期的优势微生物,对白酒发酵及产品品质有着重要的作用。解析L.acetotolerans在白酒发酵过程中的功能,对于理解与控制白酒发酵具有重要的作用。但是由于L.acetotolerans生长缓慢,不易培养的特点,目前对白酒发酵过程中该菌的分布情况、功能及其生物安全性并不清晰。因此,有必
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耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）广泛存在于不同香型的白酒发酵体系中,是发酵中后期的优势微生物,对白酒发酵及产品品质有着重要的作用。解析L.acetotolerans在白酒发酵过程中的功能,对于理解与控制白酒发酵具有重要的作用。但是由于L.acetotolerans生长缓慢,不易培养的特点,目前对白酒发酵过程中该菌的分布情况、功能及其生物安全性并不清晰。因此,有必要筛选获得白酒发酵过程中的L.acetotolerans,并对其发酵性能、代谢特征及生物安全性开展研究。本研究采用高通量扩增子测序技术,解析了L.acetotolerans在白酒体系中的分布及演替规律,筛选获得了不同L.acetotolerans菌株,基于基因组学测序技术和比较基因组学分析,解析了各菌株的基因组特征和代谢特征;建立了白酒发酵过程中L.acetotolerans的生物安全性评估流程,并对其生物安全性进行系统评估。该研究为深入解析白酒发酵过程中微生物的发酵功能及生物安全性评估提供了理论依据。本文主要研究结果如下:（1）针对白酒发酵过程中L.acetotolerans分布规律不清晰的问题,利用16S扩增子测序解析了L.acetotolerans在上述发酵样本中的分布规律和扩增子序列变异（Amplicon Sequence Variant,ASV）数量。在青海省和山西省的清香型白酒发酵样本中,L.acetotolerans占据乳杆菌科比例为0.14%～93.02%,分别有18种和8种ASV;在江苏省和山东省的芝麻香型白酒发酵样本中,该菌种占据乳杆菌科比例为1.12%～100%,分别有23种和16种ASV;表明该物种在清香型和芝麻香型白酒发酵中均具有高丰度和高种内多样性的特征。从酒醅中共筛选出4种ASV类型的L.acetotolerans菌株;对其中9株代表性的L.acetotolerans生长特征、乙醇胁迫耐受能力和底物利用能力进行分析,发现菌株G4、G10和16生长更快且稳定期生物量更高,能够更好的耐受12%（v/v）乙醇。9株L.acetotolerans均能够利用20种以上碳源物质,具有多碳源利用特征。氨基酸缺一法培养结果表明,9株L.acetotolerans对天冬酰胺、谷氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸具有依赖性。L.acetotolerans以高粱汁为培养基进行发酵,在发酵液中鉴定出乙酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸等重要风味物质。（2）针对L.acetotolerans代谢机制不清晰的问题,采用基因组学测序技术和比较基因组学分析,解析了9株菌的基因组特征。研究发现,9株L.acetotolerans菌株全基因组大小范围为1.49～1.63 Mb,GC含量为36.3%～36.8%,预测到的编码序列数量为1426～2291个。9株菌中可注释基因占总基因的比例为93.84%～99.65%,属于CAZy家族的基因数量为33～44个。L.acetotolerans中与碳源代谢相关基因主要分布在淀粉与蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、果糖与甘露糖代谢、半乳糖代谢等代谢途径,且糖酵解/糖异生代谢途径相关基因最多。基因预测结果表明L.acetotolerans具有利用代谢中间产物合成20种氨基酸的潜力,利用戊邻酮二酸盐可合成谷氨酸,利用羟苯丙酮酸可合成酪氨酸,利用丙酮酸可合成半胱氨酸;并通过氨基酸转化生成天冬氨酸和异亮氨酸。与来源于其他食品发酵系统的4株L.acetotolerans菌株相比,13株菌株共有1137个核心基因,主要与碳水化合物代谢相关;来自于白酒发酵的9株菌共有106个独有基因,主要与碳水化合物转运相关。（3）针对白酒发酵过程中L.acetotolerans生物安全性不清晰的问题,建立了白酒发酵体系中L.acetotolerans的生物安全性评估流程,包括潜在有害物质代谢活性分析,潜在致病性分析、毒力因子及耐药基因分布特征、耐药基因转移活性分析。基于该流程对9株L.acetotolerans菌株的生物安全性进行系统评估,发现这9株菌不具有合成生物胺、亚硝酸盐、溶血素的活性。尽管菌株对环丙沙星、莫匹罗星、钠盐青霉素具有耐药性,但是相关耐药基因不具备水平基因转移的活性。致病性预测该菌株致病概率为0.14～0.19,低于目前公认安全的益生菌菌株,表明白酒发酵中L.acetotolerans具有生物安全性。该研究为其他白酒优势菌株安全性评价提供了借鉴。
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