研究背景肺癌是当今世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,严重危害人类健康。其中约80-90%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。2015年国家癌症中心发布的数据表明肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。由于肺癌早期诊断较为困难,确诊的病例中大约有30%的患者在诊断时即存在远处转移,在治疗过程中仍有50-60%的病人发生远处转移,80-90%的患者死亡原因是由肺癌远处转移引起的。因此,肺癌的转移是一个目前尚未攻克的重大难题,阐明肺癌转移发生的分子机制,从而建立有效的检测手段,及早采取相应措施防止和延缓转移的发生,能大大改善患者的生存质量,延长患者的存活期。转移是一个复杂的多步骤过程。目前认为,在肿瘤远处转移过程中,EMT作用十分关键。EMT使上皮细胞丧失极性,细胞与细胞之间失去紧密连接,导致细胞骨架发生重排。发生EMT的细胞同时丧失上皮细胞粘附性和细胞骨架成份,从而获得间质细胞及具有迁移表型的特征。这种细胞的变化特点具备了浸润和转移的潜能。MicroRNA是非编码小分子RNA,长约20-25个核苷酸,广泛存在于真核生物中。micro RNA主要与靶基因m RNA的3’非编码序列结合,从而抑制m RNA的翻译,下调靶基因的表达。近几年关于micro RNAs的研究成为肿瘤研究中的热点,micro RNA通过对其下游靶蛋白的精确调控,在肿瘤的形成、生长和转移中起着关键作用,有望应用于肿瘤的早期诊断,为防治肺癌提供新的靶点。现有研究表明miR-661在乳腺癌、卵巢癌及脑胶质瘤中发挥着抑制或促进增殖、侵袭和转移等作用,但在肺癌等肿瘤中的作用及分子机制少有报道。本课题拟明确miR-661在NSCLC中的表达情况,预测其作用靶点,通过体内外实验,研究miR-661在非小细胞肺癌发生、发展和转移过程中的作用及相关分子机制。研究方法1.miR-661在非小细胞肺癌组织及细胞中的表达通过挖掘生物信息学数据库找到miR-661肺癌芯片(芯片号:GSE15008/GP/L8176/989)并进行分析,荧光定量RT-PCR方法检测miR-661在50对肺癌与癌旁组织中的表达;检测正常肺上皮细胞EBAS-2B及7种肺癌细胞株A549、SPC-A1、H460、GLC-82、PC-9、H1299和H322中miR-661表达。2.miR-661靶基因的筛选、鉴定1)使用生物信息学在线网站micro RNA.map、RNA22、miRwalk、Target Scan、Pita数据库预测miR-661的靶基因,选择五个网站的交集且预测值高的基因,并通过查阅文献,确定miR-661与肺癌的生长和转移相关的的候选靶基因RB1。2)实验荧光定量RT-PCR方法检测RB1在50例结肠癌组织中的表达,使用Western blot方法检测RB1在NSCLC细胞、组织中的表达。3)扩增包含miR-661结合位点的RB1 3’UTR基因片段,并将结合位点亚克隆至psi CHECK-2双荧光素酶的报告载体中,然后对RB1 3’UTR上与miR-661的结合位点进行定点突变。最后使用荧光素酶报告系统检测miR-661与RB1 3’UTR的结合情况,验证RB1是否为miR-661直接作用的目的靶基因。3.miR-661对非小细胞肺癌细胞的体内、体外生物学特性的影响1)通过瞬时转染miR-661过表达和干扰片段,同时使用慢病毒包装系统,稳定转染A549和SPC-A1细胞,建立过表达miR-661的稳定转染细胞株,在体外使用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成实验、细胞周期实验,以及划痕实验和Transwell迁移实验,检测miR-661过表达和干扰后对非小细胞肺癌细胞A549和SPC-A1细胞在克隆形成、增殖、迁移和运动能力的影响。2)采用裸鼠皮下成瘤实验和尾静脉注射实验检测miR-661过表达稳定细胞株A549对体内非小细胞肺癌成瘤和转移能力的影响。4.miR-661参与的非小细胞肺癌作用的机制研究利用Western blot检测非小细胞肺癌细胞株A549、SPC-A1中miR-661瞬时转染过表达、干扰和稳定转染过表达后EMT相关指标的变化;利用Western blot检测转染RB1c DNA和RB1si后E2F1和E-cadherin的变化;利用Western blot检测转染E2F1c DNA后Vimetin、Fibronectin的变化;利用免疫荧光技术检测miR-661瞬时转染过表达片段后EMT相关指标定位情况;利用染色质免疫沉淀技术验证RB1与其下游转录因子E2F1的相互作用。5.统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。使用2-(35)(35)Ct值分析细胞荧光定量RT-PCR的结果,单因素的方差分析(One-Way ANOVA)用于三组以上比较,LSD法、SNK(Student-Newman-Keuls)法用于方差齐性的多重比较,Dunnett’s T3法用于方差不齐时。两组比较采用两独立样本t检验(Independent-Samples t text),方差不齐时采用近似t检验。荧光素酶活性检测结果、平板克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。CCK8体外增殖实验采用析因设计的方差分析和单因素方差分析。研究结果(1)miR-661在NSCLC组织中表达上调。基因芯片分析结果得出,与癌旁组织相比,miR-661在60.9%(67/110例)的肺癌组织中表达上调(t=-2.931,p=0.004);50对肺癌组织中,与癌旁组织相比,miR-661在34对癌组织中表达上调(P<0.001),上调倍数为7.26倍。(2)相对于正常肺上皮细胞,miR-661在NSCLC细胞系中表达上调。荧光定量RT-PCR检测结果显示:在EBAS-2B及A549、SPC-A1、H460、GLC-82、PC-9、H1299和H322七种细胞之间,miR-661在7种非小细胞肺癌细胞中的表达高于EBAS-2B(P<0.01,P<0.001)。我们选择表达相对较高的A549和SPC-A1进行后续实验。2.miR-661的靶基因预测、鉴定。1)采用miRNA靶基因预测软件(Target Scan、RNA22、micro RNA.map、Pita和miRwalk)预测miR-661的靶基因,以miR-661为关键词,挑选五个数据库皆有交集且查阅文献证实在非小细胞肺癌中为抑癌基因,最终确定RB1为miR-661的靶基因。2)荧光定量RT-PCR检测RB1m RNA在肺癌组织中的表达,RB1m RNA在肺癌组织中表达下调,相关分析表明miR-661与RB1m RNA在肺癌癌组织中的表达存在负性相关(P<0.000,r=-0.870)。Western Blot检测RB1在NSCLC细胞株和8对NSCLC癌组织及癌旁组织中的表达。与肺上皮细胞相比,RB1在非小细胞肺癌细胞株中大部分表达下调;与癌旁组织相比,在肺癌组织中表达下调。。3)成功构建Wt RB1 3’UTR和Mut RB1 3’UTR双荧光素酶报告载体。293T细胞中几乎不表达miR-661,将Wt RB1 3’UTR和Mut RB1 3’UTR、pre-miR-661和其阴性对照(negative control)pre-miRNA、miR-661 Inhibitor及其阴性对照(negative control)pre-miRNA共转染至293T细胞中。在293T细胞中,在转染miR-661的情况下,同时转染克隆有RB1基因3’UTR质粒的实验中,与blank组相比较,hsa-miR-661组荧光素酶活性降低,差异极显著(P=0.001);hsa-miR-661组与NC组相比,差异极显著(P=0.002),说明hsa-miR-661能通过结合RB1基因3‘UTR影响其荧光活性改变。hsa-miR-661 inhibitor组与blank组相比较,差异显著(P=0.045);hsa-miR-661 inhibitor组与NC Inhibitor组相比,差异显著(P=0.038),说明hsa-miR-661 inhibitor能封闭hsa-miR-661与RB1基因3‘UTR结合影响其荧光活性改变;在转染克隆有mut RB1基因3’UTR质粒的实验中,hsa-miR-661组与blank组和NC组相比较,P>0.05,均无统计学差异,说明has-miR-661不能利用结合mut RB1基因3‘UTR改变其荧光活性,结合位点突变完全。Inhibitor组与空白组和NC inhibitor组相比,P>0.05,无统计学差异。这表明miR-661可以特异的结合于RB1 3’UTR。4)免疫荧光实验结果证实,在A549和SPC-A1细胞瞬时转染miR-661过表达片段后观察RB1,可见RB1定位于对照组膜上,而过表达组表达不明显;说明RB1是miR-661的直接靶点。3.miR-661抑制RB1的表达而促进非小细胞肺癌细胞体内外的生长和转移。1)成功构建过表达miR-661的稳定细胞株A549/LV-miR-661和SPC-A1/LV-miR-661。2)Western blot实验结果表明:瞬时过表达miR-661之后,A549和SPC-A1细胞中RB1的蛋白水平表达下调。3)CCK-8细胞增殖实验表明:瞬转miR-661过表达和干扰片段后,与Control组相比,过表达miR-661促进A549和SPC-A1细胞的增殖(P<0.001;P<0.001);而干扰miR-661后则抑制A549和SPC-A1细胞的增殖(P<0.001;P<0.001)。Transwell和划痕实验表明:过表达miR-661之后,与Control相比,A549和SPC-A1细胞迁移和运动能力增强(P<0.001;P<0.001);干扰miR-661后,A549和SPC-A1细胞迁移和运动能力减弱(P<0.001;P<0.001)。4)与LV-NC相比,稳定过表达miR-661促进A549和SPC-A1细胞的增殖能力(P<0.001;P<0.001),克隆形成能力(P<0.001;P<0.001),迁移(P<0.001;P<0.001)和运动能力(P<0.001;P<0.001)。5)恢复实验表明:与Control相比,过表达miR-661之后,A549和SPC-A1细胞迁移能力增强(P<0.001;P<0.001),而共表达miR-661/RB1c DNA之后,A549和SPC-A1细胞的迁移能力减弱(P<0.001;P<0.001)。6)裸鼠皮下成瘤实验显示:与A549/LV-NC组相比,A549/miR-661组皮下肿瘤生长速度明显增加(P<0.001);皮下瘤组织westernblot结果显示:在A549/miR-661组,靶基因RB1、E-cadherin表达下调;E2F1、Vimentin表达上调,增殖指数Ki-67表达呈强阳性。7)裸鼠尾静脉注射实验显示:A549/miR-661组肺转移结节数较对照组增多,肺转移结节数目有明显差异(T=-6.686,P=0.001;),在其他脏器中均未发现转移结节。4.miR-661、RB1和E2F1调节非小细胞肺癌作用机制的初步探讨1)Western blot检测A549和SPC-A1两种非小细胞肺癌细胞,瞬时转染miR-661过表达和干扰片段后检测EMT相关分子标志物变化。结果显示:miR-661过表达组上皮标志物(E-cadherin、β-catenin)的表达较对照组表达量低;间质标志物(Vimetin、Fibronectin)的表达较对照组表达量高;miR-661干扰后得到相反的结果。在稳转的A549/miR-661和SPC-A1/miR-661中得到与瞬转后相同的结果;而miR-661/RB1共转染后,与mir-661组比较,上皮标志物(E-cadherin、β-catenin)的表达稍高;间叶标志物(N-cadherin、Fibronectin)的表达稍低,以上结果表明:miR-661可诱导非小细胞肺癌细胞发生EMT转化,且通过抑制靶点RB1发挥促进EMT的作用。同时,与对照组Vector相比,瞬转RB1c DNA后,上皮标志物(E-cadherin、β-catenin)的表达较对照组表达量高,间质标志物(Vimetin、Fibronectin)的表达较对照组表达量高;瞬转RB1si RNA片段后,Western blot实验提示RB1si RNA组E-cadherin的表达较对照组表达量低,E2F1表达升高;瞬转E2F1c DNA组,Vimetin、Fibronectin的表达较对照组表达量高;上述结果表明RB1失活、E2F1激活可以促进非小细胞肺癌EMT过程。2)免疫荧光实验检测A549和SPC-A1两种非小细胞肺癌细胞,瞬时转染miR-661过表达片段后观察EMT相关分子标志物定位情况,结果显示:上皮标志物E-cadherin定位于对照组细胞膜上,β-catenin定位于对照组核内;间叶标志物(Vimetin、Fibronectin)定位于miR-661过表达组细胞胞浆;与对照组相比,miR-661过表达组的上皮标志物定位不明显;而间叶指标(Vimetin、Fibronectin)定位明显,说明EMT是miR-661调节非小细胞肺癌作用中的重要过程。同时可以观察到E2F1定位于miR-661过表达组细胞浆内,说明E2F1参与miR-661的生物学过程。3)利用免疫共沉淀实验检测RB1与其下游转录因子E2F1的直接结合作用,结果显示:RB1与其下游转录因子E2F1存在直接的相互作用。说明RB1与其下游转录因子E2F1共同参与了miR-661介导的非小细胞肺癌增殖、侵袭和转移的过程。结论1.miR-661在NSCLC癌组织和细胞中表达上调,miR-661具有增强非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力;初步推断miR-661在非小细胞肺癌中发挥促癌的作用。2.RB1是miR-661的靶基因,miR-661抑制RB1的表达而促进非小细胞肺癌细胞的生长,成瘤和转移能力。3.miR-661抑制RB1促进非小细胞肺癌生长、转移的过程与EMT密切相关。4.RB1与其下游转录因子E2F1,分别介导EMT,发挥miR-661促进肺癌生长、转移的作用。