研究目的为探讨内质网应激（ER Stress）在高血压导致内皮细胞损伤中的作用，本实验通过培养人脐静脉内皮细胞（human umbilieal vein endothelial cells，HUVECs)，不同浓度血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）持续刺激24小时模拟高血压状态， MTT法检测细胞的凋亡率，透射电镜观察内质网的形态学改变，免疫荧光化学和western-blotting法检测内质网应激（ER Stress）标记蛋白PERK、IRE1α、BiP、Ero1-Lα及PDI在内皮细胞中的表达；为进一步证实ER Stress在高血压血管重构和高血压内皮细胞损伤中的作用，本实验用免疫组化染色观察PERK在不同周龄自发性高血压大鼠（SHR）大鼠主动脉中的表达，从而进一步明确高血压发生发展的可能机制。研究方法第一部分：选择生长状态良好的5~8代体外培养HUVECs进行实验。相差显微镜观察细胞生长情况，待细胞活力旺盛即细胞处于对数期生长时，无血清培养6h，分组如下：①AngⅡ1组（10-5mol/L AngⅡ+无血清培养基，培养24h）②AngⅡ2组（10-6mol/LAngⅡ+无血清培养基,培养24h）③AngⅡ3组（10-8mol/L AngⅡ+无血清培养基,培养24h）④ER Stress阻断剂组（ER Stress阻断剂salubrinal+无血清培养基1h后，加入AngⅡ使终浓度至10-6mol/L，培养24h）⑤空白对照组（无血清培养基，培养24h）。收集细胞，MTT法检测细胞凋亡率，透射电镜观察内质网的形态学改变，细胞免疫荧光化学和western-blotting法检测ER Stress标记蛋白PERK、IRE1α、BiP、Ero1-Lα及PDI在内皮细胞中的表达，并观察PERK通路阻断剂salubrinal对HUVECs是否有保护作用。第二部分：饲养雄性自发性高血压大鼠（SHR）和Wistar Kyoto（WKY）大鼠各15只，每周测大鼠尾动脉压一次，分别在8、16、24周龄处死动物，取出胸主动脉，HE染色观察不同周龄高血压大鼠血管内皮细胞变化，免疫组化染色观察ER stress重要成员PERK在大鼠主动脉内皮细胞中的表达。研究结果第一部分：经MTT法检测，与对照组相比较，AngⅡ处理后HUVECs的凋亡率明显增加，随着AngⅡ浓度的增高（10-9mol/L~10-4mol/L），HUVECs的凋亡率明显增加(P<0.05)。透射电镜下观察，10-8mol/L AngⅡ处理的HUVECs出现细胞核膜不清晰，粗面内质网高度扩张、颗粒不完整；10-5mol/LAngⅡ处理的HUVECs大量细胞胞核消失，核仁崩解碎裂，细胞器稀少，内质网消失。免疫荧光化学和western-blotting检测结果表明，HUVECs正常情况下仅表达少量的PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα，AngⅡ处理显著上调PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα蛋白的表达(P<0.05)，且随着AngⅡ浓度增加，培养的HUVECs中ER stress标志蛋白表达量逐渐增加(P<0.05)，呈现浓度依赖性；经统计学分析，PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα两两之间成正相关(P<0.05)；各组细胞中PDI蛋白的表达没有明显差异(P>0.05)。观察发现，PERK通路阻断剂salubrinal对AngⅡ诱导的HUVECs凋亡没有明显的保护作用，且salubrinal本身对HUVECs有一定的毒性。第二部分：随着周龄的增加，SHR大鼠的动脉血压持续增高；8周龄开始, SHR大鼠的主动脉血管内皮细胞粗糙不平，并出现部分脱落，16周龄和24周龄后，出现的内皮细胞脱落逐渐增多；免疫组化检测，PERK在SHR组大鼠中的表达均高于同周龄的WKY组大鼠，且随着周龄的增加，PERK在SHR组大鼠中的表达也持续增加。结论1.高血压状态可以导致血管内皮细胞损伤，凋亡率增加；2. PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα蛋白等内质网应激通路蛋白可能参与了高血压诱导的血管内皮细胞损伤；3. PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα具有协同作用，共同参与高血压诱导的血管内皮损伤。