痤疮丙酸杆菌中脂肪酶基因的原核表达及其应用

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本文实现了痤疮丙酸杆菌脂肪酶的基因克隆表达,并对重组酶的酶学性质和降解作用进行研究。从痤疮丙酸杆菌基因组中克隆脂肪酶基因(liphy),与pUCm-T载体连接,构建克隆载体pUCm-T-liphy。测序正确后,将liphy亚克隆至表达载体pET-15b连接,构建充足表达质粒pET-15b-liphy,转化到宿主菌BL21(DE3)PlysS后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为37kDa的特异性条带,但较多部分以包涵体形式存在。优化表达条件,确定最优条件为:pH6.0,30℃培养,转接量1∶60,IPTG终浓度0.4mM,诱导24h。采用Ni柱对表达产物进行纯化,SDS-PAGE分析表明,纯化后条带单一,酶的纯度达到95%以上,纯化回收率为37.25%。酶学性质研究表明,该酶反应的比活力为91.43U/ml,最适pH为9.5;最适温度为30℃;具有一定的热稳定性。此外,Mg2+和Ca+对酶活有一定的促进作用,而Co2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Tween20、Tween80、Triton-100、SDS及EDTA-Na2则不同程度抑制酶活。以棕榈酸对硝基苯酯作为底物测定重组脂肪酶的Km值为36.084uM。检测该酶对SKOV3卵巢癌细胞和人二倍体细胞的毒理性,发现IC50分别为150μg/mL和300μg/mL。利用该酶进行降解实验,经检测发现对橄榄油、地沟油等具有降解作用,为脂肪酶在洗涤工业、环境治理等方面的应用奠定了基础。
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