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多溴二苯醚(PBDEs)作为著名的持久性有机污染物(POPs),它们的生物毒性引起了人们的广泛关注。PBDEs在生物体内可以代谢成羟基化的PBDEs(OH-PBDEs),其中双羟基化的PBDEs(多溴二苯醚氢醌,PBDE-HQs)会进一步氧化为醌型代谢物(多溴二苯醚醌,PBDE-Qs),而代谢物会产生与母体相似或更强的毒性。而这可能是母体诱导毒性的机制之一。前期研究表明,PBDEs及其代谢物具有神经毒性,但其内在毒理学机制尚不清楚。因此,我们以PBDE-Qs/HQs为研究对象,探究它们诱导神经细胞毒性的机制,为更好地理解PBDEs及其代谢物诱导的神经毒性提供依据。我们从PBDE-Qs/HQs的结构推测,氧化还原性及亲电性是它们诱导神经毒性的主要原因。此外,溴原子是PBDE-Qs/HQs的主要取代基团,对其性质和毒性可能具有一定影响。为此,我们合成了具有不同溴取代模式的PBDE-Qs/HQs,通过研究它们的氧化还原性,亲电性以及神经细胞毒性,从化学结构和性质的角度深入探究PBDEs代谢物的神经毒性机制。第一部分:该部分旨在合成不同溴取代模式的PBDE-Qs/HQs。首先,我们用化学合成的方法得到了醌环(含氧环)上没有溴和有一个溴的两种PBDE-Qs(bi Br-PBDE-Q和tri Br-PBDE-Q)。合成原理是基于不同溴代程度的苯醌与二溴代苯酚的取代反应。另外,通过PBDE-Qs的还原得到PBDE-HQs(bi Br-PBDE-HQ和tri Br-PBDE-HQ)。目标化合物均使用核磁共振氢谱、碳谱(~1H NMR、13C NMR)以及高分辨质谱(MS)进行结构表征,用高效液相色谱(HPLC)鉴定纯度。谱图结果表明目标化合物结构正确,纯度符合要求,可以用来进行后续实验。第二部分:该部分旨在研究PBDE-Qs/HQs的氧化还原性和亲电性。首先,我们使用电子顺磁共振(EPR)探究了它们的氧化还原性质。氢醌/半醌自由基/醌(HQ/SQ·-/Q)这三者之间氧化还原循环会导致活性氧(ROS)的累积,因此我们分析了PBDE-Qs和PBDE-HQs衍生的SQ·-并模拟计算出化合物中各原子对SQ·-峰裂分的贡献。通过定量分析醌和氢醌之间电子转移衍生的SQ·-,我们发现由tri Br-PBDE-Q和tri Br-PBDE-HQ衍生的SQ·-数量显著高于bi Br-PBDE-Q和bi Br-PBDE-HQ衍生的。同样,tri Br-PBDE-Q和过氧化氢(H2O2)产生的羟基自由基(HO·)和甲基自由基信号(·CH3)强度也高于bi Br-PBDE-Q。由此可见,醌环上溴取代增加了PBDE-Qs/HQs氧化还原活性。其次,鉴于PBDE-Qs相较于PBDE-HQs还具有亲电性,可能会和细胞内脱氧核糖核酸(DNA),蛋白质,谷胱甘肽(GSH)等亲核试剂发生加成反应。因此,我们使用MS分析了PBDE-Qs与GSH反应的加和产物来研究PBDE-Qs的亲电性。MS结果表明,tri Br-PBDE-Q和bi Br-PBDE-Q均能和GSH发生迈克尔(Michael)加成反应,而溴置换反应只有tri Br-PBDE-Q能发生,表明与GSH反应时醌环和苯环具有不同的反应性,即苯环上的溴不能被GSH取代,醌环上的溴具有更高的反应性。以上结果说明醌环上溴取代增加了PBDE-Qs/HQs的氧化还原性和亲电性。第三部分:该部分旨在研究PBDE-Qs/HQs的神经细胞毒性。上一章节我们发现了结构对PBDE-Qs/HQs的氧化还原性和亲电性有影响,这可能会引起它们诱导毒性的差异。因此,我们进一步在细胞水平上探究了PBDE-Qs/HQs诱导的神经毒性,来验证PBDE-Qs/HQs的氧化还原性和亲电性是其诱导神经毒性的主要原因。我们选择神经细胞系BV2细胞作为模型细胞系来平行地评估了PBDE-Qs和PBDE-HQs在不同毒理学终点的细胞毒性。首先CCK-8实验表明,暴露于PBDE-Qs/HQs的BV2细胞的存活率呈浓度依赖性下降,且tri Br-PBDE-Q/HQ的细胞毒性显著高于bi Br-PBDE-Q/HQ。另外通过分析细胞内ROS和GSH水平,我们发现tri Br-PBDE-Q/HQ比bi Br-PBDE-Q/HQ诱导了更多的ROS生成和更严重的GSH消耗。最后分析了PBDE-Qs/HQs的促凋亡和自噬作用,检测分析了细胞核皱缩,磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和凋亡关键蛋白的Caspase-3的表达等细胞凋亡关键事件,发现tri Br-PBDE-Q/HQ相比于bi Br-PBDE-Q/HQ诱导细胞凋亡的比例更大。同样地,通过对一些细胞自噬关键事件分析,例如自噬体的形成和LC3B-II蛋白的表达,我们发现tri Br-PBDE-Q/HQ相比于bi Br-PBDE-Q/HQ诱导诱导更高的细胞自噬水平。由此可见不同溴取代模式的PBDE-Qs/HQ诱导的细胞毒性存在显著差异,且表现为醌环上溴取代显著增加了细胞的氧化应激水平、细胞凋亡及自噬水平。综上所述,本研究证明了醌环上溴取代影响了PBDE-Qs/HQs氧化还原和亲电性,从而影响了PBDE-Qs/HQs的神经细胞毒性,这说明氧化还原和亲电性是PBDE-Qs/HQs诱导神经细胞毒性的主要原因。这一发现为PBDE-Qs/HQs诱导的神经毒性提供了新的见解,反映了其前体PBDEs的毒性机制。