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目的:口腔扁平苔藓是一种常见的非感染性口腔黏膜疾病,不易治愈,有一定的癌变倾向。该病好发于中年人,多见于40岁以上妇女,随年龄增长症状加重。该病病因不明,发病机制错综复杂。近年来,口腔扁平苔藓的癌变病例报道呈上升趋势,因此,对口腔扁平苔藓发病机制的研究成为口腔医学研究的热点。基因芯片技术是目前国际上兴起不久且发展迅速的一项生物技术,它在生命科学领域扮演着越来越重要的角色。基因芯片技术是目前基因研究方面最先进、最有效的方法之一,随着生物学技术的发展,基因芯片技术越来越广泛应用于疾病发病机制的研究,从而发现差异表达基因。本实验应用基因芯片技术筛选口腔扁平苔藓与正常口腔黏膜组织差异表达基因及其信号传导通路,分析口腔扁平苔藓发病相关的差异表达基因和信号传导通路,进而对口腔扁平苔藓的发病机制进行深入研究。方法:1样本采集所有病变组织均来源于2008年5月至11月河北医科大学第四医院口腔科临床诊断为口腔扁平苔癣的患者,并经知情同意取病理时切取少量病变黏膜(组织病理诊断为口腔扁平苔藓的继续保留)。标本于切除后10 min内装入经无菌DEPC处理的冻存管中,然后储存于液氮罐中转运到低温冰箱中保存。对照正常组织来源于河北医科大学第四医院口腔科无菌条件下健康者拔智齿时切除的龈黏膜或口腔整复术中切除的口腔黏膜,保存方法同OLP组织标本。2芯片的制作由上海康成技术有限公司提供的含有32 050个基因的高密度基因组芯片(phalanx台湾)。取适量(50~100 mg)正确保存的OLP组织样本和正常组织,分别使用BioPulverize冰冻粉碎组织,加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。使用Nanodrop测定RNA在分光光度计230 nm、260 nm和280 nm的吸收值,以计算浓度并评估纯度。用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。取得RNA QC报告。经检测的RNA样本是高质量的,完整的,没有RNase污染,没有DNA污染,继续实验。样本RNA进行逆转录反应合成cDNA,cDNA第二链合成,aRNA合成及纯化,荧光标记aRNA并纯化。使用Nanodrop检测荧光标记效率,标记效率合格以保证后续芯片实验结果的可靠性。使用Ambion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的aRNA进行片段化处理。在标准条件下将标记好的探针和高密度基因组芯片进行杂交。3芯片扫描和图像分析使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转换成数字型数据保存,使用配套软件(Genepix Pro V6.0和Genesring)对原始数据进行分析运算,采用FoldChang和T-test方法筛选的两组样本间的差异表达基因和通路,以表达差异2倍为阳性,为有统计学意义。4 RT-PCR验证结果的可靠性本实验为了排除实验结果中筛选差异基因的错误和假阳性,对实验结果部分标本的部分基因采用RT-PCR验证。实验随机选取7例标本(3例正常和4例OLP)并随机选取3个表达上调的基因(PHF19、DBH、CD72)进行RT-PCR验证,为校正此差异,将RNA反转录合成cDNA。PCR扩增。引物序列为: GAPDH :反义5’GGGAAACTGTGGCGTGAT3’,正义:5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA3’,片段长度为299 bp。PHF19::反义F:5’CGGGAAGATCAAGAGGGTCA3’,正义: R:5’ATGCAGCGTCGGCAGAAC3’,片段长度为276 bp。DBH:反义F:5’TGGTGATAGAAGGACGAAACG3’,正义: R:5’GCAGTAGCCAGTG AGGATGAA3’,片段长度为158bp。CD72:反义F:5’CCAAATGGTGGTTCA GGGA3’,正义: R:5’GGCACAGGTTCTTGTTGGC3’,片段长度为265bp。PCR反应条件: 95℃变性3min, 40个PCR循环(94℃,20s;59℃,20s;72℃,30s);72 oC延伸5 min。PCR反应同时扩增GAPDH作为内参照,复性温度及循环次数根据不同引物及模板进行调整PCR产物与100 bp DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带并进行灰度扫描成像。RT-PCR验证结果由Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0(Build 14)软件处理。5统计学方法应用Spss 13.0统计软件进行统计学处理,实验数据各组间比较利用单样本均数比较T检验分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1经过杂交筛选并与正常组织比较,从32 050个基因中筛选出有统计学意义的差异表达基因142个,其中上调表达基因25个,下调表达基因117个。这些差异基因从分子生物学角度来说大部分是细胞突变、生理性改变免疫应答、增殖等。从细胞组成角度来讲大多是细胞器、细胞外基质、蛋白质的合成等。从分子功能角度讲大多是黏附、催化活性、信号传导功能、酶的活性等。2有差异表达的通路8个,为感染类疾病相关通路,氨基酸、蛋白质、碳水化合物的合成和代谢类、聚糖的生物合成和代谢类及外源性化学物质的合成和代谢类,与OLP密切相关通路是与参与感染类疾病的幽门螺杆菌感染上皮细胞信号传导通路(Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection )。结论:1.应用基因芯片可初筛选出口腔扁平苔藓差异表达基因和信号传导通路,2.口腔扁平苔藓发生、发展过程中存在着多条不同基因的表达差异,是一种多基因变化的级联反应。3.口腔扁平苔藓的发生、发展过程中存在着信号传导功能通路表达调控的改变。