研究背景:周围神经损伤是一种常见的疾病,由于神经再生缓慢且再生过程中干扰因素较多,从而导致神经损伤后的恢复效果常不尽如人意,很多患者因此留下慢性后遗症甚至终生残疾。巨噬细胞作为机体固有免疫细胞,在促进神经稳态、神经再生方面发挥着重要的作用。由于巨噬细胞具有高度可塑性,在不同的刺激因素的作用下,巨噬细胞会表现出不同的极化形态,从而发挥出截然不同的作用。因此,如何通过改变巨噬细胞的极化而产生相应免疫修复功能,从而使其在神经修复中起到积极的作用是目前研究的热点。肌酸作为重要的细胞供能物质,目前未见肌酸作用于周围神经修复的相关文献报道。此外,尽管近期的许多实验和临床研究证实了肌酸的神经保护治疗作用,以及肌酸对巨噬细胞表面的IFN-γ受体的抑制作用,但对于肌酸能否对周围神经损伤具有修复效果有待进一步的研究。基于此,为进一步探讨肌酸是否能够促进小鼠受损周围神经的修复,本研究首先建立周围神经损伤的小鼠模型。随后,在建立的模型基础上,探讨肌酸能否促进小鼠损伤周围神经的修复。最后,在细胞及动物水平上,对肌酸促进周围神经修复的机制进行探讨。研究目的:1.构建小鼠的周围神经损伤动物模型,并基于所构建的动物模型,探究肌酸是否可以促进模型小鼠损伤周围神经的修复。2.基于上述的建立的周围神经损伤小鼠模型,进一步探讨肌酸处理后模型小鼠受损周围神经处巨噬细胞的募集和极化状况。3.基于永生化小鼠巨噬细胞体外模型以及周围神经损伤小鼠体内模型,对肌酸调控巨噬细胞极化的机制进行进一步的探讨。研究方法:第一步:周围神经损伤动物模型的建立。通过挤压法,建立坐骨神经的损伤小鼠模型。同时处死小鼠,取损伤处坐骨神经,进行石蜡切片,通过Hematoxylin-Eosin染色法检测所建立小鼠模型的坐骨神经损伤等级是否满足研究需求。第二步:肌酸对模型小鼠的损伤周围神经修复效果探究。首先,小鼠被随机分为5组,分别为:第一组:坐骨神经挤压损伤后未经治疗组（CON组,n=35）;第二组:暴露坐骨神经,但不进行损伤组（SHAM组;n=35）;第三组:坐骨神经挤压损伤后,腹腔给予IL-4进行治疗组（IL4组;n=35）;第四组:坐骨神经挤压损伤后的第1-4天腹腔给予肌酸治疗组（CR1组;n=35）;第五组:坐骨神经挤压损伤后的第5-8天腹腔给予肌酸治疗组（CR2组;n=20）;其次,通过Rotarod转棒试验、Sciatic Function Index坐骨神经指数测量试验对小鼠运动功能的恢复程度进行检测;在损伤后第16天,各组分别处死3只模型小鼠,解剖损伤处坐骨神经,并通过透射电镜对受损的坐骨神经上的有髓神经纤维直径及髓鞘厚度进行分析。第三步:肌酸促进损伤周围神经修复机制的研究。首先,将肌酸与巨噬细胞共孵育48h后,采用Western blot检测不同类型的巨噬细胞标记物的表达情况。同时检测JAK2/STAT1通路相关的蛋白表达情况,探讨肌酸对巨噬细胞极化经典通路JAK2/STAT1的影响。同时采用CCK8法,检测肌酸的药物毒性;其次,根据上述分组,在mRNA水平、蛋白水平上,通过RT-qPCR、Western blot、免疫荧光染色,对不同组别小鼠损伤处及远端坐骨神经的巨噬细胞相关蛋白标记物及炎性细胞因子的表达进行定量及定性分析,并对巨噬细胞的分布进行了研究。根据上述分组,取损伤处神经组织,通过对CD31、S100以及NF160进行免疫荧光染色,探究不同组别模型小鼠的受损周围神经组织处新生血管再生能力、髓鞘的形成能力以及轴突神经丝再生能力的差异。研究结果:研究结果1:肌酸能够促进周围神经损伤模型小鼠运动功能的恢复。Rotarod试验证明,肌酸治疗组的小鼠在棒上时间明显长于对照组。在损伤后第8天,与CON组相比,CR1组的时间显著升高。在损伤后第12天,相较于CON组,CR2组开始出现显著的增高。在损伤后第16天,相较于CON组,IL4组、CR1组、CR2组坚持时间均明显延长,其结果与CON组相比具有显著的统计学差异。根据SFI测量结果,从损伤后第8天开始,相较于CON组,CR1组及CR2组均开始表现出改善,其结果具有统计学意义。在损伤后第16天时,CR1组与CON组相比,CR2组与CON组相比,均具有显著性的改善,且CR2组的改善程度大于CR1组,说明采用肌酸治疗后,周围神经损伤的模型小鼠的运动功能得到了明显的恢复。透射电镜结果表明,较于CON组,采用肌酸治疗后,周围神经损伤小鼠的有髓纤维直径明显增加,髓鞘厚度明显增大,CR1组及CR2组的有髓纤维直径及髓鞘厚度均大于CON组,且存在统计学差异。说明肌酸能够促进模型小鼠的受损周围神经的恢复。研究结果2:肌酸能够在体内外抑制小鼠M1型巨噬细胞的极化,并在一定程度上增加M2型巨噬细胞的极化,从而促进损伤的周围神经的修复。细胞实验结果表明,肌酸可以抑制IFN-γ信号通路相关蛋白的表达。（肌酸+IFN-γ）组中的p-STAT1和p-JAK2表达水平明显低于IFN-γ单独处理组,但高于PBS单独处理组。各组中STAT1和JAK2的表达水平无显著差异。先经肌酸处理的巨噬细胞中,CD86和iNOS表达水平明显低于IFN-γ单独处理组,但高于PBS处理组。CCK8结果显示细胞增殖程度未受到肌酸浓度的影响。周围神经损伤模型小鼠显示,较于空白对照组,在采用肌酸治疗后,M1型巨噬细胞相关的标记物表达降低,M2型巨噬细胞相关的标记物表达升高。RT-qPCR、western blot以及免疫荧光结果显示在神经损伤后4天时,相较于CON组,CR1组以Arg-1的表达为主,两者表达量具有显著统计学差异。同时,相较CON组,p-STAT6的mRNA表达也显著增加。CON组则以M1型巨噬细胞的标记物iNOS表达升高为主,同时信号蛋白p-STAT1的表达水平也随之升高。CON组TNF-α及IL-1β的mRNA相对表达量最高,IL-4组及CR1次之,SHAM组表达量最低。CR1组与CON组表达量存在统计学差异。相较CON组,CR1组的VEGF及IL-1表达显著增高。在损伤后16天时,各组蛋白的mRNA表达量均有较大幅度的下降。CR2组的Arg-1蛋白mRNA表达量高于CON组,这两组数据具有统计学意义。p-STAT6的mRNA表达趋势与Arg-1一致,即,CR1组的mRNA表达量要高于CON组,其分析结果同样具有统计学意义。各组之间的iNOS与p-STAT1的mRNA表达量之间相差不大。M1型和M2型巨噬细胞相关的细胞因子的表达也具有类似的变化。此外,Western blot和免疫荧光染色结果显示,对照组浸润的巨噬细胞以M1巨噬细胞为主,肌酸处理组以M2巨噬细胞为主。通过将内皮细胞标记物CD31与EdU共染,以及分别对髓鞘、轴突神经丝特异性标记物S100、NF160进行免疫荧光染色后发现,较于CON组,采用肌酸治疗后,CD31、S100及NF160的表达均显著增高,说明肌酸能够通过促使模型小鼠受损处神经血管再生、髓鞘的形成以及轴突神经丝再生,进而促进损伤神经的修复。研究结论:经上述对肌酸在周围神经损伤修复影响及相关作用机制的探究,本研究最终得出的结论如下:1.周围神经损伤后给予腹腔注射肌酸,可以促进神经损伤处巨噬细胞的聚集,进而促进血管再生,募集雪旺细胞至损伤处,促进轴突的再生。小鼠运动功能发生明显改善。2.肌酸可以通过抑制IFN-γ与受体结合,抑制下游的JAK2/STAT1通路的表达,从而减少M1型巨噬细胞的极化,并在一定程度上促进其向M2型巨噬细胞极化。在损伤4天后再给予肌酸,可以获得更好的修复效果。