论文部分内容阅读
目的:利用环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二(2-乙己基)酯(DEHP)干预,建立Sprague-Daw1ey大鼠隐睾模型,观察隐睾大鼠睾丸组织生殖母细胞生长发育情况,检测隐睾大鼠远期生殖功能,并通过分析Notch信号通路关键信号分子Notch1和Hes1以及Notch信号通路调控因子EGFR和TGF-α在mRNA和蛋白质水平的表达,初步探讨Notch信号调控在隐睾导致雄性不育症中的作用;同时进行体外原代培养新生Sprague-Daw1ey雄性大鼠的睾丸生殖母细胞,并通过γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号通路的表达,观察生殖母细胞在Notch信号表达不足的情况下的生长发育变化情况,进一步阐述Notch信号通路在隐睾所致不育症中的作用。方法:SPF级妊娠Sprague-Daw1ey大鼠随机分为三组,每组20只,分别为:正常对照组、玉米油对照组和DEHP隐睾实验组。玉米油对照组和DEHP隐睾实验组自妊娠12.5天到妊娠18.5天分别持续经口予以玉米油和DEHP500mg/kg/d,正常对照组予等量PBS灌胃。收集生后20天的雄性子鼠,统计隐睾发生率,将每组留5只饲养至成年检测其生殖功能,剩余雄性子鼠断颈处死,收集标本。通过组织学水一平、流式细胞检测及生殖功能实验观察睾丸生殖母细胞在三个实验组的生长发育变化及远期生殖功能,同时通过实时荧光定量PCR以及Western Blotting技术检测Notch信号通路关键信号分子Notch1和Hes1以及Notch信号通路调控因子EGFR和TGF-α在mRNA和蛋白质水平的表达。体外通过原代培养新生Sprague-Daw1ey雄性大鼠的生殖母细胞,利用特异性抑制剂DAPT来抑制Notch信号通路的表达,通过细胞迁移实验、细胞增殖实验及流式细胞检测细胞凋亡来综合分析生殖母细胞的生长发育情况。结果:DEHP诱导Sprague-Daw1ey隐睾大鼠睾丸内生殖母细胞发育明显障碍,具体表现为生殖母细胞迁移延迟、凋亡增加和分化障碍,而正常组和玉米油对照组大鼠睾丸生殖母细胞发育正常,相对应隐睾大鼠远期生殖功能明显下降,表明生殖母细胞发育障碍与远期不育相关;检测发现隐睾大鼠中Notch信号通路关键信号因子Notch1及Hes1在mRNA和蛋白质水平的表达与正常组和玉米油对照组相比均有降低,同时Notch信号的抑制信号EGFR及TGF-α在基因和蛋白水平的表达升高,差异均具有统计学意义(p<0.05);体外培养的原代生殖母细胞用DAPT抑制Notch信号通路表达之后,生殖母细胞的生长发育明显出现障碍,进一步表明Notch信号在生殖母细胞生长发育中起到关键性的调控作用。结论:隐睾中存在生殖母细胞生长发育障碍,与远期不育率密切相关,同时隐睾中Notch信号通路关键信号分子在基因和蛋白质水平的表达均有异常,体外实验证实DAPT抑制Notch信号通路表达之后原代培养的生殖母细胞生长发育障碍,表明Notch信号通路在生殖母细胞生长发育过程中起到重要的调控作用,进而可能与隐睾导致的远期不育症相关。