第一部分Dermol和Twist在人类卵巢癌、乳腺癌、胃癌中的表达及功能分析高度保守的转录因子Dermol和Twist都属于碱性Helix-loop-helix(b-HLH)蛋白家族,它们具有结构的高度同源性,功能的部分相似性。b-HLH家族蛋白在细胞分化、胚胎发育的调控中具有重要作用,同时广泛参与多种组织的形成,如:骨、肌肉、神经、心脏、造血组织等。最新研究成果表明Twist能促进细胞存活,抑制非恶性细胞分化,诱导非恶性细胞肿瘤发生,促进恶性细胞肿瘤形成、发展和转移,也参与多种难治性肿瘤抗药性(破坏微管药物如taxol和vincristine)的形成。近来发现,乳腺癌、恶性黑色素瘤以及其他肿瘤中Twist过表达可作为预后不良的一个指标,许多证据表明Twist蛋白也参与调节细胞凋亡。在人类肿瘤中Twist活化可能具有非常重要的临床意义,Twist很可能作为指导诊断、判断预后的指标,并可作为肿瘤生物治疗的一个新靶点。作为twist基因的高度同源类似物,dermol基因分布更为广泛,表达强度在不同组织存在很大差别,但是它在发育和肿瘤发展过程中的作用尚不清楚。本论文中,我们比较了Dermol和Twist在多种人类肿瘤中的作用,分析了Dermol在卵巢癌生长、存活、侵袭以及转移中的功能。我们首先采用免疫组化(SP法)研究Dermol、Twist在人类卵巢癌、乳腺癌、胃癌中的表达定位状况,探讨它们在不同类型肿瘤中的表达特点。结果表明在不同种类的人类肿瘤中Dermol与Twist蛋白表达模式不同。我们首次发现:Dermol在卵巢癌中表达明显增加,主要分布在细胞质和细胞膜上;在乳腺癌中的表达也显著增高,主要分布在细胞质中,细胞核也有一定程度表达;而在胃癌组织中,与非癌胃组织、癌旁胃粘膜组织相比较,表达明显降低。进而证明Twist与卵巢癌之间没有相关性;在乳腺癌中表达增加,主要分布在细胞核中;在非癌胃组织、癌旁组织及胃癌组织中虽然均有一定表达,主要分布在细胞质中,但未见存在显著性差异。提示Dermol、Twist蛋白在不同的正常组织或非癌组织所发挥的作用不同,在不同肿瘤中亦有不同的功能。鉴于Dermol在人类卵巢癌中表达增加,我们构建了dermol基因在真核细胞的表达载体,筛选出稳定超量表达dermol(转基因)的卵巢癌HO-8910细胞株,通过体外研究过表达Dermol所产生的形态学变化、亚细胞定位以及对细胞功能的影响,并利用动物模型研究体内过表达Dermol的功能变化,以揭示Dermol与表型性状间的关系。结果表明,外源Dermol蛋白表达在细胞核内,Dermol蛋白过表达对细胞增殖速度、细胞周期分布影响不大。但是与人类卵巢癌中Dermol升高的结果一致,动物实验表明Dermol的确能促进肿瘤生长、转移,我们进而对其机制进行进一步研究,发现缺氧压力胁迫作用下卵巢癌细胞发生凋亡,Dermol可能至少部分通过激活PI-3K-Akt通路,增加Bcl-2、减少Bad,以对抗缺氧诱导的卵巢癌细胞凋亡,从而利于卵巢癌存活,利于皮下肿瘤的生长。稳定过表达Dermol的卵巢癌细胞粘附能力不变,非锚定依赖能力增加,并且细胞出现极性,由上皮样向成纤维梭形形态转变,很可能通过促进EMT转变,使间叶细胞标记物Vimentin、fibronectin表达增加,增加迁移、侵袭转移能力。本研究发现Dermol、Twist蛋白在乳腺癌中表达均明显增加,有一定的相似作用;而在卵巢癌、胃癌中所起作用不同。Dermol一方面可能至少部分通过激活PI-3K-Akt通路对抗缺氧诱导的卵巢癌细胞凋亡,从而利于卵巢癌存活、生长,另一方面很可能通过促进EMT转变,增加癌细胞迁移、侵袭、转移能力,在卵巢癌中发挥促癌作用。在胃癌中的作用以及机制尚有待研究。对于Dermol功能的研究,将有助于我们对同一基因在不同肿瘤中差异作用的认识,有助于对卵巢肿瘤的发生、发展机制的进一步了解,同时对预防、早期诊断、判断预后、治疗恶性肿瘤均具有重要指导意义。第二部分Dermol和twist基因在肿瘤细胞中的甲基化调控DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传机制,与肿瘤的发生和演进有密切联系。甲基化通过直接或间接地影响调控因子与DNA的相互作用以及染色质结构而抑制转录,而不涉及有关基因DNA序列的改变,并可通过减数分裂遗传。多种基因启动子甲基化状态的改变在肿瘤细胞是一种常见特点,并且往往发生在肿瘤形成早期,破坏基因功能的突变通常在基因组位置的比较大范围内存在差异,而启动子CpG岛甲基化的位置对于某个基因却是不变的。由于采用非常少量的DNA即可检测出特异性DNA甲基化这一稳定的分子变化,近年研究中常应用特异性的DNA甲基化检测发生已知遗传突变的基因,作为肿瘤早期诊断的生物标记物。利用甲基化机理可以阐明一个或多个调控系统异常是如何导致肿瘤的,并且DNA甲基化的变化是可逆的,研究特定基因DNA甲基化将有助于恶性肿瘤分类,肿瘤基因治疗的开发,指导临床用药,帮助判断预后。Dermol和twist属于Helix-loop-helix(b-HLH)蛋白家族中的一对转录因子,在细胞分化、胚胎发育的调控中具有重要作用,我们第一部分的研究结果表明,在不同类型肿瘤中Twist和Dermol有不同的表达方式,它们的异常表达有助于肿瘤的发生,而DNA甲基化模式可反映基因的表达状态。已有研究证实twist是乳腺癌中高甲基化的基因,慢性淋巴细胞白血病患者中dermol基因启动子上游调控区域的甲基化抑制该基因的表达。由于在肿瘤中DNA甲基化调控具有肿瘤组织和细胞特异性,且不同肿瘤组织中高甲基化的基因不同,肿瘤细胞中DNA甲基化型式的变化常用于研究基因表达调节的内在机制,我们研究并比较了twist(twist1与dermol(twist2)DNA的5’CpG岛甲基化型式和基因表达状态。我们先对dermol启动子附近1000bp的序列进行分析,基于对所研究基因富含GC这一特点的认识,我们考虑到启动子DNA甲基化参与表达调控的可能性。为研究这一新的癌相关基因的表观调控机制,我们采用亚硫酸盐PCR(Bisulfite PCR,BS-PCR),亚硫酸盐基因组测序,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)分析包括白血病、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞株Dermol基因启动子区域甲基化图谱。先选择有甲基化可能性的CG岛设计BS-PCR引物,将经亚硫酸盐修饰的CpG岛进行PCR扩增,得到450bp的片段。先用特异性甲基化敏感位点酶酶切分析BS-PCR产物,初筛发现不同细胞株中所研究基因启动子区域均有不同甲基化片段存在;随后对BS-PCR扩增产物进行亚硫酸盐基因组测序分析,找到所扩增基因启动子局部区域在不同细胞株中的甲基化图谱;然后根据基因组测序结果设计出用于MSP的2对M、U引物以区分甲基化和非甲基化状态,同时对MSP产物进行亚硫酸盐基因组测序以验证MSP结果的正确性。本研究共检测14株人类肿瘤细胞(HL60,Molm14,MV4-11,RS4:11,HepG2,Huh7,Skhep1,BT-549,MDM-BA231,MCF7,skBr3,H358,H1299以及Hela)dermol基因的甲基化状态,利用RT-PCR研究这些细胞株中dermol基因的表达水平。由于dermol与twist结构的同源性以及功能的重叠性,同时对twist的甲基化图谱以及基因表达情况进行了比较研究。应用BSP我们发现不同肿瘤细胞株中dermol基因启动子CpG位点甲基化型式不同,MSP分析提示dermol在12/14(85.71%)细胞株中为部分甲基化,在2/14(14.29%)细胞株中为完全甲基化,RT-PCR表明dermol mRNA在绝大多数肿瘤细胞株中(12/14,85.71%)有不同程度的阳性表达。在这些肿瘤细胞株中Dermol启动子的普遍甲基化提示这一基因存在甲基化的表观调控方式。应用MSP发现所研究的肿瘤细胞株中twist启动子有7/14(50%)为完全甲基化,4/14(28.57%)为部分甲基化,1/14(7.14%)为未甲基化,但是有2株细胞未能检测出信号。RT-PCR提示超过一半的肿瘤细胞株(57.14%)不表达twist mRNA,但有4/14(28.57%)twist有显著表达,2/14(14.29%)表达低水平的twist mRNA。综上所述,dermolmRNA在绝大多数肿瘤细胞株中有不同程度的阳性表达,至少部分通过甲基化调控基因的表达,且甲基化调控方式普遍存在于多种不同类型的肿瘤中;twist表达方式与dermol不同,在半数肿瘤细胞株不表达,该基因的沉默在一定程度上是通过甲基化调控的,甲基化调控方式同样普遍存在于多种不同类型的肿瘤中,人类肿瘤细胞中dermol与twist mRNA表达的调节均有基因启动子甲基化调控的参与。探讨转录因子twist和dermolDNA甲基化调控机制,有助于全面了解各种肿瘤的甲基化模式,有助于阐明致癌机理,对肿瘤分型、预后判断、早期诊断、肿瘤的基因治疗提供一定的理论基础。