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[目的]本课题组前期研究miR-503在人退变椎间盘髓核组织中异常高表达,细胞实验也证实miR-503参与髓核细胞的衰老凋亡。通过生物信息学方法预测miR-503与lncRNA MALAT1具有共同的结合位点。本部分实验目的在以下三点:1.研究lncRNA MALAT1和miR-503在退变及正常椎间盘髓核组织的表达差异;2.构建体外髓核细胞培养损伤模型,探讨IL-1β诱导髓核细胞凋亡最佳浓度,并在体外细胞实验中研究lncRNA MALAT1对miR-503的调控作用;3.探讨lncRNA MALAT1与miR-503互作调控影响椎间盘髓核细胞退变的机制。[方法]1.第一部分:在骨科脊柱手术患者中挑选病例,收集髓核组织样本;提取髓核组织RNA,实时定量PCR方法检测lncRNAMALAT1和miR-503的表达量。2.第二部分:在骨科脊柱手术患者中挑选病例,收集正常或者轻度退变髓核组织样本。培养髓核细胞,观察细胞的形态结构;使用IL-1β对髓核细胞进行刺激培养,CCK-8方法检测髓核细胞活力,流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率。甲苯胺蓝染色和实时定量PCR方法检测细胞角蛋白19mRNA鉴定髓核细胞。通过IL-1β诱导髓核细胞凋亡,提取髓核细胞RNA,实时定量PCR方法检测lncRNA MALAT1、miR-503表达水平。通过lncRNA MALAT1过表达质粒及其阴性对照组质粒转染髓核细胞,提取髓核细胞RNA,实时定量PCR方法检测lncRNAMALAT1与miR-503表达水平。3.第三部分:使用 miR-503 mimic、miR-503 inhibitor、lncRNA MALAT1 过表达质粒及相应阴性对照质粒转染髓核细胞。CCK-8方法检测髓核细胞活力,流式细胞仪检测髓核细胞凋亡。实时定量PCR技术检测lncRNA MALAT1、miR-503,MMP3、TIMP1、Collagen I、COL2A1 mRNA 的表达量。Western Blot检测 MMP3、TIMP1、Collagen I、COL2A1 的蛋白表达水平。[结果]1.第一部分实验结果:实时定量PCR结果表明:与正常组相比,髓核样本中lncRNAMALAT1 表达量降低(P<0.05),miR-503 表达量升高(P<0.05)。2.第二部分实验结果:(1)分离培养椎间盘髓核细胞,显微下观察细胞形态为长梭形、多角形;(2)甲苯胺蓝染色为阳性表现;(3)角蛋白19 mRNA在人的髓核细胞中显著高表达(P<0.00 1);(4)IL-1 β(75ng/ml)、IL-1 β(150ng/ml)组细胞活性明显降低(P<0.05),呈时间依赖梯度;(5)IL-1β(150ng/ml)细胞凋亡率明显增加(P<0.05);(6)IL-1β诱导髓核细胞后lncRNAMLAT1表达水平降低(P<0.001),miR-503 表达升高(P<0.001);(7)过表达 lncRNA MALAT1后,miR-503表达水平下降(P<0.001)。3.第三部分实验结果:(1)lncRNAMALAT1与miR-503在IL-1β诱导髓核细胞中互作调控表达:与normal组相比,经IL-1β诱导损伤后,各实验组lncRNA MALAT1表达均明显降低(P<0.05),miR-503 表达均明显升高(P<0.05)。与 mimic control组相比,miR-503 mimic组miR-503表达水平明显升高(P<0.05),lncRNA MALAT1 表达水平明显降低(P<0.05);与 inhibitor control 组相比,miR-503 inhibitor 组 miR-503 表达水平明显降低(P<0.05),lncRNA MALAT1 表达明显升高(P<0.05);与 miR-503 mimic+ov control 组相比,miR-503 mimic+ov MALAT1组miR-503表达水平明显降低(P<0.05),lncRNAMALAT1表达水平明显升高(P<0.05);与 miR-503 inhibitor+ov control 相比,miR-503 inhibitor+ov MALAT1 组 miR-503 表达水平降低(P<0.05),lncRNAMALAT1 表达水平升高(P<0.05)。(2)CCK-8检测细胞活力:与normal组相比,各实验组细胞活力均明显下降(P<0.05);与mimic control组相比,miR-503 mimic组细胞活力下降(P<0.05);与 inhibitor control 组相比,miR-503 inhibitor 组细胞活力升高(P<0.05);与 miR-503 mimic+ov control 组相比,miR-503 mimic+ov MALAT1 组细胞活力升高(P<0.05);与 miR-503 inhibitor+ov control 组相比,miR-503 inhibitor+ov MALAT1 组 miR-503 细胞活力升高(P<0.05)。(3)流式细胞术检测细胞凋亡:与normal组相比,各实验组细胞活力均明显升高(P<0.05);与mimic control组相比,miR-503 mimic组细胞凋亡率升高(P<0.05);与 inhibitor control 组相比,miR-503 inhibitor 组细胞凋亡率下降(P<0.05);与 miR-503 mimic+ov control 组相比,miR-503 mimic+ov MALAT1 组细胞凋亡率下降(P<0.05);与 miR-503 inhibitor+ov control 组相比,miR-503 inhibitor+ov MALAT1 组细胞凋亡率下降(P<0.05)。(4)lncRNAMALAT1与miR-503竞争性调控髓核细胞外基质退变:与normal组相比,经IL-1β诱导损伤后,各实验组MMP3 mRNA、Collagen I mRNA表达水平明显升高(P<0.05),TIMP1 mRNA、COL2A1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05);与 mimic control 组相比,miR-503 mimic 组 MMP3 mRNA、Collagen I mRNA 表达明显升高(P<0.05),TIMP1 mRNA、COL2A1 mRNA表达明显降低(P<0.05);与 inhibitor control组相比,miR-503 inhibitor 组 MMP3 mRNA、Collagen I mRNA 表达明显降低(P<0.05),TIMP1 mRNA、COL2A1 mRNA 升高(P<0.05);与 miR-503 mimic+ov control 组相比,miR-503 mimic+ov MALAT1 组 MMP3 mRNA、Collagen I mRNA 表达降低(P<0.05),TIMP1 mRNA、COL2A1 mRNA 表达升高(P<0.05);与 miR-503 inhibitor+ov control组相比,miR-503 inhibitor+ov MALAT1 组 MMP3 mRNA、Collagen I mRNA表达水平降低(P<0.05),TIMP1 mRNA、COL2A1 mRNA表达水平升高(P<0.05)。Western Blot 检测 MMP3、Collagen I、TIMP1、COL2A1 蛋白表达水平,与实时定量PCR检测相关mRNA表达水平一致。[结论]1.在人退变髓核组织中lncRNAMALAT1表达下调,miR-503表达上调,lncRNA MALAT1与miR-503可能参与椎间盘退变;2.在IL-1β诱导髓核细胞损伤模型中lncRNAMALAT1负向调控miR-503表达,调控髓核细胞凋亡;3.lncRNA MALAT1下调miR-503介导的MMP/TIMP动态失衡及胶原转化(Collagen I合成增加,CollagenⅡ合成减少),抑制髓核细胞基质降解、退变。