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表观遗传是在不改变DNA的序列的情况下对DNA或染色体的修饰。DNA甲基化是主要的表观遗传修饰,具有重要的调控功能。DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)能够催化甲基从S腺苷甲硫氨酸转移到DNA。哺乳动物中的DNMT家族有五个成员:DNMT1,DNMT2,DNMT3A,DNMT3B,DNMT3L,其中DNMT3L因缺少催化结构域而不具有任何催化活性,但会与DNMT3A和DNMT3B相互作用促进它们的活性。 Wnt信号通路是胚胎发育过程中重要的组成,其中经典Wnt通路依赖β-catenin转运到细胞核中,通过与T细胞因子/淋巴增强结合因子(T-cell factor/lymphoidenhancer-binding factor, TCF/LEF)结合,激活或抑制下游基因的表达。CHIR99021与PD0325901能够起到抑制细胞分化的作用,其中CHIR99021是常用的GSK3β的抑制剂,通过抑制此酶活性,使β-cateenin在核内积累,达到Wnt后续的转录信号传递。 本文首先利用实时定量PCR实验,确定了不同浓度CHIR99021对甲基转移酶家族基因的表达影响,发现对Dnmt31基因有明显下调作用,而对于Dnmt3a,Dnmt3b等其余家族基因没有明显作用。利用蛋白免疫印迹实验确定了针对小鼠F9细胞,最适的CHIR99021处理浓度为10μM,并以此为重点进行后续研究,确定CHIR99021下调基因的具体机制。 通过构建pCMV-Myc-β-catenin、pCDNA3.1-β-catenin和pCDNA3.1-β-catenin S37A载体,利用核质蛋白分离提取实验以及蛋白免疫印迹实验发现,CHIR99021对F9细胞处理后,β-catenin蛋白的总表达量有明显提高,并且细胞质和细胞核内的β-catenin含量都比对照组高,说明,CHIR99021可以通过抑制GSK3β来增加细胞质中β-catenin的稳定性,并且入核量也随之增高。通过双荧光素酶报告实验证明CHIR99021会对Wnt/β-catenin经典通路造成影响,激活该通路。过表达β-catenin后,Dnmt31基因的表达出现下调,因此可得,在小鼠F9细胞中CHIR99021能够通过抑制GSK3β,使β-catenin在细胞核中积累,激活Wnt/β-catenin经典通路,最终导致Dnmt31基因的抑制。 β-catenin进入细胞核后,通常会与TCF/LEF复合体共同作用,并激活基因的转录,而对于本文研究基因Dnmt31的抑制效果很少见。此复合体中起到抑制效果的只有TCF3蛋白,其余成员起转录激活效果,而近期研究对TCF3的抑制机制并不明确,而且对其在经典Wnt通路的作用没有准确和唯一的答案,因此,我对TCF3在此机制中的作用进行了研究。本实验利用RNA干扰,免疫荧光染色,实时定量PCR和蛋白免疫印迹实验,确定下调Tcf3(Tcf7l1)基因的表达会对Dnmt31基因有上调的影响,并且Tcf3和β-catenin基因在经过CHIR99021处理24h后,都具有上调效果。 综上,本研究证明了CHIR99021能够通过抑制GSK3β,使β-catenin在细胞核中积累,激活Wnt/β-catenin经典通路,β-catenin与核内的TCF3结合,共同抑制Dnmt31基因的表达,为CHIR99021促进胚胎干细胞的自我更新能力提供理论依据。