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背景狂犬病,一种古老的人兽共患病,由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起,除南极外各大洲都有分布,其感染谱广,温血动物均易感,可造成严重脑炎。该病是病死率（近100%）最高的疾病之一。全球每年约5.9万人死于狂犬病,即每9min就有1人死于该病。亚洲每年约3.5万人死于犬介导的狂犬病,约占全球死亡人数的59.6%。目前尚无有效疗法及抗病毒药物,接种疫苗是最有效的方法。狂犬病疫苗广泛使用,其免疫保护机制依赖于传统的“免疫-加强”原理,免疫特征尚未被完全阐释,特别是细胞免疫。前期有学者通过增强体液免疫应答来增强狂犬疫苗的免疫原性,如表达双拷贝或三拷贝的G蛋白、巨噬细胞炎症蛋白1-α（MIP-1α）、鞭毛蛋白等。细胞免疫认识的缺乏,导致低水平或非保护性的细胞免疫反应,因此本研究想通过表达一种细胞因子增强细胞免疫,以了解细胞免疫在狂犬疫苗免疫反应中发挥的作用。白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等均参与细胞免疫,其中,IL-33属于IL-1家族,是一种核警报蛋白,来源广泛,在多种细胞和器官上都有表达。有研究证实,IL-33能在呼吸道病毒感染相关疾病、柯萨奇病毒B5（CVB5）感染、小鼠巨细胞病毒（MCMV）感染、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染中发挥作用。IL-33 C-端IL-1结构域,与ST2受体结合,当有病毒侵入机体时,细胞或组织损伤释放IL-33,可诱导Th1与Th2型免疫反应,协调保护性抗病毒细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应,参与细胞免疫。因此,本研究旨在构建表达IL-33的重组狂犬病病毒,分析IL-33的过表达对RABV的生物学特性、致病性及其诱导的适应性免疫反应的影响,为研究RABV的免疫特征,尤其是细胞免疫的相关作用机制提供理论依据。目的1)以RABV弱毒株LBNSE株为载体,构建表达IL-33的重组病毒LBNSE-IL-33;2)体外细胞实验研究LBNSE-IL-33是否正确表达IL-33及其对RABV生长动力学特性的影响;3)动物免疫实验分析IL-33对RABV的致病性、体液免疫、细胞免疫及保护性的影响,为研究RABV体液免疫、细胞免疫的相关作用机制提供理论依据。方法1)重组病毒LBNSE-IL-33的构建及鉴定:利用Pfl23II、NheI 2个酶切位点和T4 DNA连接酶构建全长感染性克隆,转染BHK-21细胞获得重组病毒。利用RT-PCR实验对基因组鉴定,通过免疫荧光（IFA）、蛋白免疫印迹（Western Blot）和流式细胞术（FACS）对蛋白表达情况进行鉴定。绘制生长曲线了解其生长动力学特性。2)重组病毒LBNSE-IL-33的致病性分析:6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为3组,分别免疫LBNSE-IL-33、LBNSE、DMEM,免疫后3W内观察小鼠的饮食、精神状态及体重变化等。3)重组病毒LBNSE-IL-33对RABV感染保护能力评价:免疫后4W,进行RABV感染,感染后连续观察小鼠状态3W,绘制生存曲线和临床症状评分图,并取脑组织进行RT-PCR鉴定。4)重组病毒LBNSE-IL-33诱导的特异性抗体水平检测:小鼠免疫后1、2、4W,通过荧光抗体病毒中和实验（FAVN）滴定血清中的中和抗体水平,利用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定RABV特异性抗体亚型IgG1与IgG2a水平,及其比例。5)重组病毒LBNSE-IL-33诱导小鼠募集活化树突状细胞（DC）、B细胞能力检测:小鼠免疫后3、6、9天,取淋巴结及外周血,检测淋巴结中活化的DC和B细胞以及外周血中活化的B细胞。6)重组病毒LBNSE-IL-33诱导小鼠产生特异性T细胞能力检测:免疫后1、2、4W,取小鼠脾脏,经RABV抗原刺激,利用流式细胞术检测CD8+T细胞、CD4+Th1和Th2细胞的比例。小鼠免疫后1、2、4、8W,分离小鼠脾脏淋巴细胞,利用酶联免疫斑点实验（ELISpot）检测RABV特异性T细胞的数量。结果1)重组病毒LBNSE-IL-33拯救成功,RT-PCR结果表明病毒基因组构建正确,IFA、Western Blot及FACS结果表明重组病毒同时表达RABV G蛋白和IL-33蛋白,且大小与预期一致。生长曲线结果显示重组病毒的峰值滴度在BHK-21细胞上与亲本株LBNSE无差异,在Neuro-2a细胞上略高于LBNSE（P＜0.05）,外源基因IL-33的插入未影响重组病毒的复制增殖。2)三组小鼠在免疫后3W内体重均呈增长趋势,与空白组、LBNSE组相比无明显差异（P＞0.05）,小鼠毛发光滑,无精神状态异常变化,表明LBNSE-IL-33无明显致病性。3)感染后3W内,LBNSE-IL-33组小鼠未出现任何异常症状,且能对小鼠提供RABV感染的保护。4)抗体检测发现,免疫后1、2、4W的中和抗体均值分别为2.55IU/ml,6.86IU/ml,5.24IU/ml,均高于WHO认定的有有效保护能力的抗体水平0.5IU/ml,且第2W时,LBNSE-IL-33组的中和抗体水平明显高于LBNSE组,差异显著（P＜0.01）。ELISA实验结果显示,LBNSE-IL-33与LBNSE一样可诱导产生特异性IgG1和IgG2a抗体,1W时LBNSE-IL-33组两种抗体效价均值分别为1:459.48、1:475.48,均高于LBNSE组（P＜0.05）,且 4W 和 8W 时,LBNSE-IL-33 组 IgG2a 效价仍高于 LBNSE 组（P＜0.05）。5)FACS结果显示,与空白组、LBNSE组相比,LBNSE-IL-33可诱导小鼠募集、活化更多的DCs和B细胞（P＜0.05）。6)FACS结果显示,LBNSE-IL-33组CD8+T细胞、CD4+Th1和Th2细胞的比例更高（P＜0.05）。ELISpot实验结果显示,与空白组、LBNSE组相比,LBNSE-IL-33可诱导产生更多数量的RABV特异性T细胞（P＜0.05）。结论本研究构建了表达IL-33的重组病毒LBNSE-IL-33,IL-33的表达促进RABV快速诱导产生体液免疫与细胞免疫,单次免疫小鼠即可快速诱导产生良好的免疫原性和保护效力,为IL-33增强RABV疫苗的细胞免疫相关作用机制研究提供理论依据,为研发新型、安全、高效的狂犬病疫苗提供新的思路。