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红曲菌(Monascus spp.)是我国重要的微生物资源,在发酵过程中能产生红曲色素、多种水解酶以及具有生理活性的MonacolinK、麦角固醇、γ-氨基丁酸等物质。主要应用于食品着色、酶制剂生产、酿酒和各种传统食品如腐乳等方面,在中药生产和保健品方面也具有重要的价值。近年来多种真菌基因组测序结果表明,真菌基因组含有的可以合成次级代谢产物的基因簇的数量远比表达出的多,大部分基因簇在实验条件下未能表达,被称为沉默基因簇。如何激活这些沉默的基因簇并使之表达,发现新的天然产物成为研究的热点。研究表明,一些化学表观遗传修饰剂,主要是组蛋白去乙酰化酶和DNA甲基化酶抑制剂,可以改变基因簇所处的表观遗传状态,激活沉默基因簇的表达从而诱导真菌产生新的代谢产物。本课题研究了几种化学表观遗传试剂对红色红曲菌(M.ruber)M7形态发育与生长,以及色素与桔霉素等次级代谢产物的影响,同时也研究了组蛋白去乙酰化酶抑制剂二氢香豆素(Dihydrocoumarin,DHC)对红曲菌不同PKS基因表达活性的影响。1.几种表观遗传修饰剂对红色红曲菌M7菌落和显微形态的影响选取组蛋白去乙酰化酶抑制剂:DHC(Dihydrocoumarin)、SB(Sodiumbutyrate)、SAHA(Suberoylanilide hydroxamic)、NT(Nicotinamide)、TSA(Trichostatin A);DNA甲基化酶抑制剂:5-AZA(5-Azacytidine),共6种常用的表观遗传试剂,研究它们对红色红曲菌(M.ruber)M7形态的影响。结果表明,在本实验浓度范围内,M7菌落直径随DHC(0～5mM)、TSA(0～20μM)、5-AZA(0～100μM)浓度的增加而逐渐变小;随NT(0～10mM)、SB(0～100mM)、SAHA(0～1OOOμM)浓度的增加先变大后变小。当DHC浓度为2mM以上时,菌落直径明显变小,气生菌丝减少,菌落中心出现褶皱。TSA、5-AZA浓度为2μM时菌落直径均明显变小。添加TSA后,气生菌丝变少,菌落中间出现褶皱;添加5-AZA后,菌落四周不规则。SB浓度高达50mM时M7菌落直径仍比对照组高,菌落颜色变深,气生菌丝减少。NT浓度达5mM时菌落直径比对照组大;10mM以上时菌落直径变小,菌落中心有深红色的附着物。SAHA浓度在200μM以上时菌落颜色变浅,菌落中央呈白色,边缘变得不规则。显微观察结果表明,M7 在含 0.5mM DHC,0.5mM SB,5μMSAHA,0.5mM NT,2μM 5-AZA的PDA平板上均生长良好,均产生闭囊壳和分生孢子,几种试剂对菌丝形态并没有显著的影响。2.表观遗传修饰剂对红曲菌M7液态发酵生物量、色素和桔霉素产量的影响。在本实验的浓度范围内,添加SB、SAHA、NT、5-AZA后M7的生物量随浓度的增加先升高后降低;而添加DHC、TSA后M7生物量随浓度的增加而降低。SB、SAHA、NT、5-AZA在PDB培养基中终浓度分别在5mM、200μM、2mM、2μM以内时,促进M7菌丝球的生长,生物量提高;DHC、TSA浓度分别在2mM、5μM时,M7的生长均受到了明显的抑制。DHC、SAHA浓度分别在5mM、200μM以内时,菌丝体的色素产量随浓度增加而升高,发酵液的色素含量却随浓度增加而降低。SB、5-AZA浓度分别在5mM、2μM以内时,菌丝体及发酵液的色素含量均随浓度的增加而升高。低浓度的NT促进M7红色素的生成,8mM以上浓度的NT抑制了 M7红色素的生成。M7发酵液桔霉素的含量均随这几种试剂浓度的增加而减少,其中DHC、NT、TSA抑制桔霉素的产生现象比较明显。3.表观遗传修饰剂对红曲菌M7色素成分的影响添加DHC、SB、SAHA、NT、TSA、5-AZA这几种试剂后,M7的HPLC图谱中并未发现新峰。添加DHC后,M7中四种蓝色荧光的物质含量升高,分别为BF1-1(m/z=416,C23H28O7)和 BF1-2(m/z=444,C25H32O7),以及 BF2-1(m/z=374,C21H26O6)和 BF2-2(m/z=402,C23H30O6)。BF2-1 和 BF2-2 这两个物质为 Monasfluol A 和 Monasfluol B。BF1-1为Monascusazaphilone C;而分子量为444的BF1-2未发现有报道,根据其结构式命名为 12-OAc-monasfluol B。4.组蛋白去乙酰化酶抑制剂DHC对红曲菌M7不同PKS表达活性的影响采用Real-time PCR的方法对红曲菌M7几种不同PKS基因(GME1661、2523、2757、4561、6078、6749、7032、7327、7426基因)在添加DHC后的表达活性进行了研究。结果发现,添加DHC后红曲菌桔霉素PKS基因GME2757的表达水平明显下调,其它几种PKS基因的表达水平并无明显的变化规律。第三章中红曲菌M7添加DHC后,发酵液桔霉素含量显著降低,DHC如何影响桔霉素的生成还需要进一步的分析。