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Bcl-2家族蛋白是内源凋亡通路“开关”,其成员之间通过BH3结构域形成复杂的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI),组成一个具有多时空层次、冗余性、连通性和代偿性的分子网络,调控细胞的生死平衡。研究表明,多个Bcl-2家族成员都会受到上游蛋白激酶通路的精确调控,进而发生磷酸化修饰并改变其凋亡调节功能。尽管目前Bcl-2家族成员的磷酸化位点已经基本阐明,但Bcl-2家族网络磷酸化修饰后的新特征还没有揭示,并且磷酸化修饰调控这一分子网络的作用机制也缺乏有说服力的结论。S1是由本课题组研发的、具有自主知识产权的小分子BH3模拟物。它的特异性高于同类分子Gossypol,与临床试验期的ABT-737相当,仅通过靶向Bcl-2家族网络诱导细胞凋亡。而且S1能够同时拮抗Bcl-2和Mcl-1这两个关键的抗凋亡Bcl-2家族网络节点蛋白,而ABT-737不能拮抗Mcl-1蛋白。本文以S1作为分子工具,平行对比ABT-737和Gossypol,通过诱导抗性、免疫印迹、免疫共沉淀、外源转染、基因沉默、定量PCR、等温滴定量热(ITC)等多种方法,在Bcl-2家族蛋白相互作用网络中研究了磷酸化修饰后Bcl-2和Mcl-1蛋白抗凋亡功能的改变,明确了参与其磷酸化修饰的信号通路,揭示了磷酸化修饰后Bcl-2家族蛋白质相互作用网络的新特征以及新的网络平衡动态调控机制。以S1和ABT-737为工具的研究,在小细胞肺癌(SCLC)细胞内揭示了一条Bcl-2表达上调继而发生高度磷酸化(S70)的信号通路：S1等BH3模拟物的凋亡诱导刺激→内质网应激→MEK/ERK通路激活→CREB/STAT3活化→Bcl-2转录上调；MEK/ERK通路激活→Bcl-2高度磷酸化→正反馈激活ERK1/2。这一结果在分子水平上揭示了小细胞肺癌中的内质网应激激活的MEK/ERK通路与Bcl-2家族网络之间的串话机制(crosstalk)。Bcl-2蛋白在S70位点的磷酸化修饰能够增强自身的抗凋亡功能,因此在调控Bcl-2家族网络动态平衡中扮演关键角色：磷酸化Bcl-2(S70)(pBcl-2(S70))不仅通过结合更多促凋亡蛋白,重塑Bcl-2家族网络,而且能够通过正反馈激活ERK1/2,进一步放大抗凋亡信号,最终导致小细胞肺癌细胞产生对BH3模拟物的原发性和获得性抗性。在白血病细胞系和白血病患者外周血或骨髓的原代肿瘤细胞中,以S1为工具的研究进一步明确了Bcl-2蛋白通过磷酸化修饰增强了自身的抗凋亡功能。虽然Bcl-2与Bak的相互作用鲜有报道,但本文却发现了pBcl-2(S70)能与Bak形成新的相互作用。研究表明,pBcl-2(S70)/Bak是Bcl-2磷酸化修饰(S70)后调控网络平衡的关键二聚体。这对二聚体的出现重塑了Bcl-2家族网络的特征：在S1的刺激下,Bak等促凋亡蛋白能够在Mcl-1和pBcl-2(S70)这些网络节点之间发生穿梭,而pBcl-2(S70)是S1所不能拮抗的的关键节点。这一新的作用模式明确了pBcl-2(S70)调节网络动态平衡的分子机制。数据统计分析显示,pBcl-2(S70)/(Bcl-2+Mcl-1)是预测S1在白血病细胞中敏感性的一个综合指标。这一指标的发现从另一个角度反映出pBcl-2(S70)是在Bcl-2家族网络中发挥抗凋亡功能的,Bcl-2蛋白的磷酸化(S70)增强了网络的抗凋亡能力。利用S1对比ABT-737和Gossypol,在黑色素瘤细胞中的研究揭示了Mcl-1通过磷酸化修饰(T163)增强了自身的抗凋亡功能,进而对抗BH3模拟物的凋亡诱导作用。证明MEK/ERK和JNK通路共同介导了黑色素瘤细胞中Mcl-1的磷酸化(T163). pMcl-1(T163)通过重新捕获被BH3模拟分子从Bcl-2上释放的促凋亡蛋白,表现出“替补”的抗凋亡作用,维持了网络的稳健性。因此,pMcl-1(T163)是黑色素瘤一个新的治疗靶点。经过基于细胞的筛选,结合ITC试验,获得一个能够直接结合pMcl-1(T163)的BH3模拟物-Compound6。研究表明,Compound6能诱导Mcl-1降解,并且不依赖Noxa单剂诱导黑色素瘤细胞凋亡。