乳腺癌（breast carcinoma）是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病机制尚未明确。雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）是一种核转录因子，ERα调节细胞和基因特异性转录的确切机制尚不完全清楚，近年的研究表明，雌激素及ERα参与了乳腺癌细胞增殖，分化，凋亡等多个生物学过程，在乳腺癌的发生发展中起重要作用。精氨酸甲基转移酶（arginine methyltransferases，PRMTs）家族是一个在哺乳动物中常见的酶类，目前已经发现有11个成员。它们在细胞内的生物学作用非常广泛，包括细胞生长，核/浆蛋白转运，胚胎分化、形成，RNA剪接与转运，转录后调节等。PRMT2被确认是一种ERα的共激活子，并可能参与肺功能活动，炎症反应，凋亡促进，瘦素信号传导及Wnt信号传导等多种机制而发挥不同的转录调节作用。然而迄今为止，其在乳腺肿瘤中的作用仍不清楚，更没有PRMT2差异剪接体的报道。本研究通过免疫组织化学的方法检测正常乳腺组织和乳腺癌组织内PRMT2蛋白、ERα蛋白的表达，发现并验证了PRMT2基因在乳腺癌中的表达高于正常乳腺组织。在此基础上，通过SMART RACE与RT-PCR技术获得PRMT2四个新的剪接体，并通过Northern blot和Western blot鉴定其在多种组织器官和肿瘤细胞中的表达，real-time RT-PCR检测各剪接体在不同乳腺癌细胞株中的表达，构建GFP重组表达质粒，脂质体介导转染乳腺癌细胞，激光共聚焦显微镜观察重组质粒的亚细胞定位，采用萤火虫荧光素酶双报告基因系统检测PRMT2及其各剪接体对ERE-LUC转录活性及对Snail与E-cadherin启动子活性的影响，GST-pull down与免疫共沉淀方法检测PRMT2及其差异剪接体与ERα的体内外相互作用。构建靶向PRMT2基因的microRNA真核表达载体，鉴定其稳定转染乳腺癌细胞株MCF7后对细胞生长增殖和裸鼠移植瘤生长的影响。结果发现，获得PRMT2四个新的剪接体在多种组织器官和肿瘤细胞存在差异表达，在ERα阳性乳腺癌细胞中显著高于ERα阴性乳腺癌细胞，并具有不同的亚细胞定位。PRMT2的差异剪接体均能直接与ERα体内外相互作用，并提高雌激素介导的ERE-LUC的转录活性及调节Snail与E-cadherin启动子活性，靶向prmt2基因的pcdnatm6.2-gw/emgfp-mir真核表达载体在稳定转染mcf7细胞后能够增加雌激素介导的mcf7细胞的增殖和克隆形成，促进erα目标基因cyclind1和c-myc的表达，促进细胞周期过程，促进裸鼠移植瘤的生长。实验结果表明prmt2基因参与了乳腺癌erα信号传导途径。第一部分乳腺癌组织中PRMT2和ERα蛋白的表达及意义目的：探讨PRMT2、ERα蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义。方法：采用免疫组织化学法，检测198例乳腺癌、20例乳腺正常组织中PRMT2及ERα蛋白的表达。结果：乳腺癌与乳腺正常组织中PRMT2蛋白阳性表达率分别为79.8%和20.0%，两者比较有显著性差异（P<0.05）；其中ERα阳性乳腺癌组织中PRMT2蛋白阳性表达率为88.7%，而ERα阴性乳腺癌组织中PRMT2蛋白阳性表达率为57.1%，两者比较有显著性差异（P<0.05）。在ERα阳性乳腺癌组织中，PRMT2蛋白的表达与组织学分级有关(P=0.013)。结论: PRMT2蛋白在乳腺癌中阳性表达显著高于癌旁正常乳腺组织，在ERα阳性乳腺癌中显著高于ERα阴性乳腺癌组织，且在ERα阳性乳腺癌中PRMT2蛋白阳性表达率与组织学分级有关。第二部分PRMT2新剪接体的鉴别与表达分析目的：克隆与鉴别PRMT2四个新的剪接体及其在乳腺癌细胞中的表达。方法：通过SMART RACE与RT-PCR技术获得PRMT2四个新的剪接体，采用Northern blot和Western blot鉴定其在多种组织器官和肿瘤细胞中的表达，real-time RT-PCR检测各剪接体在不同乳腺癌细胞株中的表达，构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescenceprotein,GFP）为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-PRMT2/α/β/γ/L2，脂质体介导转染乳腺癌细胞，激光共聚焦显微镜观察外源性PRMT2及其各剪接体蛋白在细胞中的定位。结果：成功获得PRMT2四个新的剪接体，Northern blot鉴定其主要表达于雌激素靶器官，Western blot鉴定四个新的剪接体在各肿瘤细胞和胎儿组织中存在差异表达。real-time RT-PCR检测PRMT2及其剪接体的表达在ERα阳性乳腺癌细胞中显著高于ERα阴性乳腺癌细胞。激光共聚焦显微镜观察PRMT2α与PRMT2γ同野生型PRMT2一样，主要表达于细胞核，核仁除外，胞浆中有少量表达，PRMT2β均匀分布于细胞核和胞浆，包括核仁，PRMT2L2则主要分布于胞浆。结论：成功获得PRMT2四个新的剪接体，它们在多种组织器官和肿瘤细胞存在差异表达，在ERα阳性乳腺癌细胞中显著高于ERα阴性乳腺癌细胞，具有不同的亚细胞定位。第三部分PRMT2新剪接体与ERα相互作用目的：探讨PRMT2及其剪接体对ERE-LUC转录活性及Snail与E-cadherin启动子活性的影响，并与ERα相互作用的分子机制。方法：采用萤火虫荧光素酶双报告基因系统检测PRMT2及其各剪接体对ERE-LUC转录活性及Snail与E-cadherin启动子活性的影响，采用GST-pull down与免疫共沉淀方法检测PRMT2及其差异剪接体与ERα的体内外相互作用及其作用的区域。结果：PRMT2及其差异剪接体均能提高ERα介导的ERE-LUC的转录活性，且均能够直接调节Snail与E-cadherin的启动子活性，PRMT2及其差异剪接体均能直接与ERα体内外相互作用，PRMT2的N端对其与ERα的结合和增强其介导的ERE-LUC的转录活性都是必要的。结论：PRMT2的差异剪接体均是ERα的共激活子。PRMT2的差异剪接体均能与ERα体内外相互作用。PRMT2的N端对其与ERα的结合和增强其介导的ERE-LUC的转录活性是必要的。第四部分靶向PRMT2基因的microRNA对雌激素介导的乳腺癌MCF7细胞生长增殖的影响目的：构建靶向PRMT2基因的microRNA真核表达载体，鉴定其稳定转染乳腺癌细胞株MCF7后对细胞生长增殖的影响及对MCF7细胞裸鼠移植瘤生长的作用，探讨PRMT2在乳腺癌发生中的作用。方法：根据PRMT2mRNA序列设计合成pre-microRNA片段，定向克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体，并稳定转染至MCF7细胞中。采用间接免疫荧光法和western blot检测重组体对PRMT2表达的干扰效果以确定其生物活性。采用结晶紫实验和平板克隆形成实验检测重组体对MCF7细胞体外增殖和细胞克隆形成能力的影响；FCM检测重组体对细胞周期的影响。同时分别扩大培养稳定高表达重组质粒PRMT2-N-miRNA和PRMT2-C-miRNA的MCF7细胞及空载体control-miRNA的MCF7细胞，将三种瘤细胞接种于裸鼠背部皮下，通过测量三组裸鼠移植瘤体积、瘤重，评价PRMT2-miRNA转染对MCF7细胞裸鼠移植瘤生长的影响；采用免疫组织化学方法检测MCF7细胞裸鼠移植瘤中Cyclin D1和c-myc蛋白的表达。结果：构建的重组体插入片段的碱基序列完全正确，并且重组体稳定转染MCF7细胞后成功干扰PRMT2基因的表达。在无处理因子情况下，重组体对细胞的生长速度无明显影响；与转染空载体的MCF7细胞相比，稳定转染重组体的MCF7细胞对雌激素的敏感性增强，但其对4-OHT处理的敏感性无明显差异。平板克隆实验表明，重组体能够增强雌激素介导的MCF7细胞侵袭能力；FCM检测表明，重组体的细胞G2期细胞比例明显升高（P<0.05）。成功建立了PRMT2-N-miRNA、PRMT2-C-miRNA及空载体control-miRNA的MCF7细胞裸鼠移植瘤模型。与空载体control-miRNA的MCF7细胞组比较，PRMT2-N-miRNA与PRMT2-C-miRNA组裸鼠移植瘤生长速度明显增快、体积明显增大（P<0.05）。 PRMT2-N-miRNA与PRMT2-C-miRNA组裸鼠移植瘤瘤重大于control-miRNA的MCF7细胞（P<0.05）。PRMT2-N-miRNA与PRMT2-C-miRNA组裸鼠移植瘤瘤中Cyclin D1和c-myc蛋白表达明显强于control-miRNA组(P<0.05)。结论：成功构建靶向PRMT2基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体，且在稳定转染MCF7细胞后具有生物学活性。抑制内源性PRMT2基因的表达能够增加雌激素介导的MCF7细胞的增殖和克隆形成，促进ERα目标基因CyclinD1和c-myc的表达，促进细胞周期过程。抑制内源性PRMT2的表达能促进MCF7细胞裸鼠移植瘤生长；移植瘤中PRMT2的低表达能增强Cyclin D1和c-myc蛋白的表达。