第一部分 结直肠侧向发育型肿瘤分子标志物的筛查背景：大肠癌(Colorectal cancer, CRC)是当前全球范围内常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率都处于恶性肿瘤前列。由于人们生活方式及饮食机构的西方化,我国结直肠癌发病率和死亡率亦逐年增加。结直肠侧向发育型肿瘤(laterally spreading tumors, LSTs)为直径≥10mm的结直肠平坦型肿瘤性病变,是结直肠癌的重要癌前病变,其起病隐匿,早期常无明显的临床症状,多在常规结肠镜检查时发现。LSTs在早期大肠癌中约占6%,我科研究发现LSTs常规结肠镜检出率为0.8%,癌变率占11.5%,故此病在我国发病率并不低。LSTs因其呈侧向和沿肠壁环周生长,且其进展为黏膜下浸润癌的机率小于近似大小的隆起型病变,故LSTs更适合于内镜下切除治疗。但LSTs术后复发率较高,易导致LSTs复发甚至癌变。蛋白质组学应用于临床疾病如肿瘤的研究,主要是鉴定机体在正常生理状态与异常疾病状态下的蛋白质表达水平,并对这些不同状态下差异表达的蛋白质进行定量分析。定量蛋白质组(quantitative proteomics)是从蛋白质组学水平上对基因表达进行准确的定量分析,是比较蛋白质组学的核心研究内容,目前广泛应用于疾病发病机制以及药理调控机制等研究。同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)是由美国ABI应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation, ABI, USA)2004年研发的新的体外同位素标记技术。其主要流程是蛋白酶切后形成多肽,用iTRAQ同位素试剂标记多肽N末端或赖氨酸侧链基团。标记后的肽段经过液相分离,进行一级质谱和二级质谱分析,在二级质谱前,被标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比和其他理化性质。而在二级质谱中,信号离子表现为不同质荷比(114-121)的峰,根据波峰的高度及面积,可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。iTRAQ与传统的双向电泳定量分析相比具有以下技术优势：1、标签种类多,可同时对8个样本进行分析；2、体外标记,适用于所有生物样本；3、灵敏度高,检测限低,可检测出低丰度蛋白；4、分离能力强,分析范围广,iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定,包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白,膜蛋白和不溶性蛋白；5、结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠；6、自动化程度高：液相与质谱连用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。但iTRAQ技术对检测标本的蛋白含量要求较高：蛋白总量不少于50ug,蛋白浓度最低不少于5ug/uL,否则同位素无法标记。因iTRAQ操作过程更简单,定性、定量同时进行,实验结果可靠且重复性好,相对其他蛋白定量技术优势明显,故其为目前主流的蛋白质定量技术。目的：通过蛋白质组学技术鉴定并分析出结直肠LSTs特异性表达的蛋白质,以期找到导致其侧向生长发育的可能的分子机制；同时探知与其病情进展相关的蛋白质标记物,提高结直肠LSTs的早期诊断率、疗效以及改善预后。方法：随机收取结直肠LSTs大肠隆起型腺瘤性息肉、大肠小的扁平腺瘤型息肉(d<lcm)、大肠癌及正常对照组大肠组织标本,每组各20例。分别从各组织样品中提取蛋白,加入胰酶消化,酶解后的多肽用同位素相对与绝对定量(iTRAQ)试剂进行标记,混合标记后的肽段,用强阳离子交换柱(SCX)和反相色谱柱(RPLC)进行二维分离,然后经基于QE的液质联用进行液相串联质谱分析并进行蛋白质定量鉴定,通过Mascot数据库进行检索得到结直肠LSTs患者的差异蛋白质谱,并对其进行标准生物信息分析。结果：本研究通过同位素相对绝对定量(iTRAQ)技术联合多维固／液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)研究策略,共鉴定到4955个蛋白,22587个肽段,其中含21095个Unique肽段。经过比对分析,共有2001个蛋白被鉴定为差异表达蛋白,其中上调蛋白数量分别为：结直肠LSTs组/正常对照组361,结直肠LSTs组/隆起型腺瘤组189,结直肠LSTs组/扁平腺瘤组151,结直肠LSTs组/大肠癌组325；下调蛋白数量分别为：结直肠LSTs组/正常对照组318,结直肠LSTs组/隆起型腺瘤组201,结直肠LSTs组/扁平腺瘤组153,结直肠LSTs组/大肠癌组303；总差异蛋白数量分别为：结直肠LSTs组/正常对照组679,结直肠LSTs组/隆起型腺瘤组390,结直肠LSTs组/扁平腺瘤组304,结直肠LSTs组/大肠癌组628。(注：当蛋白丰度差异倍数达到1.2倍以上,且经统计检验其P值小于0.05时,视为差异蛋白。)进一步统计分析发现,结直肠LSTs存在着特异性表达的蛋白质,即结直肠LSTs与大肠隆起型腺瘤性息肉、大肠小的扁平腺瘤型息肉、大肠癌组织及正常大肠粘膜组织相比,均存在着相同的差异性表达的蛋白质共55个：共同上调的差异蛋白质14个,共同下调的差异蛋白质41个。根据GO功能注释分析,被鉴定出的结直肠LSTs差异表达的蛋白质中,具有结合功能的差异蛋白所占比例为49.54%,其次是具有酶催化活性作用的蛋白占28.39%,具有酶调节活性功能的差异蛋白占4.51%,其余差异表达的蛋白质涉及免疫防御反应、血管新生等功能。而被鉴定出的结直肠LSTs55个差异表达的蛋白质中以具有结合功能和运输代谢功能的蛋白质为主。结论：通过iTRAQ定量蛋白质组学技术,我们成功地鉴定出了结直肠LSTs差异表达的蛋白质谱,并筛选出一批结直肠LSTs特异性表达的蛋白质,其中多种蛋白质具有结合功能、酶调节活性功能和运输代谢等功能,提示结直肠LSTs差异表达的蛋白质参与的细胞代谢过程与功能通路在其病程进展过程中发挥了重要的作用。第二部分结直肠侧向发育型肿瘤分子标志物的验证与临床评价背景：结直肠侧向发育型肿瘤(LSTs)患者包括其早期患者的诊断目前还没有特异性好、敏感度高的标志物。对于结直肠LSTs发生、发展机制的研究,尤其是在分子水平的研究证实其由腺瘤转化为癌的过程中伴随着许多蛋白质种类和数量的改变,而其中涉及结直肠LSTs分化调控的特异性表达的蛋白质可能会成为具有结直肠LSTs特征性的、并具有较高诊断价值的分子标志物及潜在的治疗靶点。利用Western blot、血清ELISA和免疫组织化学方法可以对蛋白质进行定量、定位研究,对疾病的诊断及预后方面具有重要意义。目的：对与结直肠LSTs特异性表达的蛋白质进行鉴定及验证。方法：随机收取LSTs及正常对照组血清标本,每组各30例。应用RT-PCR的方法对结直肠LSTs组、隆起型腺瘤组、扁平腺瘤组、大肠癌组及正常对照组大肠组织中差异表达的蛋白质进行mRNA水平的验证。应用westernblot的方法验证LCN-2、MMP-9蛋白在结直肠LSTs、隆起型腺瘤、扁平腺瘤、大肠癌及正常大肠组织中的表达。采用ELISA双抗夹心法和免疫组织化学验证LCN-2、MMP-9蛋白在结直肠LSTs及正常大肠组织中的表达水平。组间比较采用独立样本t检验(Independent-Samples t Test)或单向方差分析(One-way ANOVA)及后续的基于方差分析的多重比较方法(满足方差齐性时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法),Spearman(非双变量正态分布资料或者等级资料,相关系数用rs表示)相关系数分析LCN2与MMP9蛋白表达以及免疫组化结果与临床病理特征的相关性,P<0.05为差异有统计学意义。结果：我们选择了4个与肿瘤病情进展密切相关但目前在LSTs研究领域报道较少的蛋白即LCN-2、SORD、RAB25. CPA3先进行Real Time PCR实验。结果发现与正常对照组相比,结直肠LSTs组中LCN-2、SORD、RAB25 mRNA表达显著升高(P值分别为0.000,0.000,0.043), CPA3 mRNA表达显著下降(P=0.000),其中LCN-2 mRNA在5组组织中差异表达的趋势与蛋白组学结果最为一致。随后对LCN-2及与其功能密切相关的且在LSTs组织中显著上调的MMP9蛋白进行Western blot、免疫组化验证,发现LCN-2、MMP9在结直肠LSTs组织中的表达较正常组显著升高(P值分别为0.000,0.000)；且二者在组化中的表达强度相关分析结果表明：MMP-9蛋白表达与LCN-2蛋白表达存在正相关关系(rs=0.631,P=0.000)；且LCN-2、MMP-9蛋白表达均与病理分级存在正相关关系(相关系数分别为rs=0.943, P=0.000; rs=0.684, P=0.000)。结直肠LSTs患者血清LCN-2、MMP-9蛋白浓度均显著高于正常对照组(P值分别为0.000,0.000)；MMP-9蛋白表达与LCN-2蛋白表达存在正相关关系(rs=0.815,P=0.000)；且LCN-2、MMP-9蛋白表达均与病理分级存在正相关关系(相关系数分别为rs=0.927, P=0.000; rs=0.924, P=0.000)。结论：经质谱分析筛选出来的差异蛋白中,LCN-2和MMP-9在结直肠LSTs患者肿瘤组织及血清中的表达水平均显著增高,且LCN-2在LSTs组织中的表达与其病理分级程度呈正相关,提示LCN-2和MMP-9可能与LSTs病情发展密切相关,为结直肠LSTs病情进展及分子标志物的研究提供了新的实验依据。LCN-2蛋白对于提高结直肠LSTs早期诊断率及改善预后具有较大的临床应用价值,可能成为预测结直肠LSTs诊断、预后监测和防治的重要指标。第三部分结直肠侧向发育型肿瘤生长机制的初步探讨背景：结直肠LSTs是一种特殊形态的平坦型大肠腺瘤,其具有以下特点：病变直径≥10mm；生长方式为沿肠腔侧向扩展或环周生长而非垂直向下生长；依据其表面形态特征分为颗粒型及非颗粒型。结直肠LSTs是进展期结直肠癌的重要癌前病变,病理以管状绒毛腺瘤或管状腺瘤为主。与隆起型肿瘤相比,结直肠LSTs有较高的凋亡指数和较低的增生指数。这样特殊的细胞凋亡和细胞增生的动力学赋予结直肠LSTs独特的表面特征,侧向发育的生长方式、恶变后黏膜下浸润发生率低和相对低恶性潜能。但既往的分子生物学研究主要集中于结直肠LSTs甲基化的研究,关于其侧向生长发育方式的机制仍不清楚。本课题组在前期蛋白组学研究的数据分析中发现,与正常大肠黏膜组织、隆起型腺瘤及大肠癌组织相比,桥粒胶糖蛋白家族成员Desmoglein2 (DSG2)、Plakophilin3b (PKP3)、Junction Plakoglobin(JUP)在结直肠LSTs中的蛋白表达水平均显著上调。提示桥粒家族蛋白DSG2、PKP3、JUP可能在结直肠LSTs的生长发育过程中扮演着重要的作用。桥粒主要由两类蛋白质构成：一类是跨膜蛋白,为钙粘着蛋白家族成员,主要包括桥粒芯糖蛋白(Desmoglein, DSG)与桥粒芯胶粘蛋白(Desmocollin, DSC),分别构成桥粒的细胞间接触层和电子致密层；另一类为细胞胞浆内的桥粒斑,主要由桥粒斑蛋白(Desmoplakin, DP).桥粒斑珠蛋白(Plakoglobin, PG)和桥粒斑菲素蛋白(Plakophilins, PP)构成,桥粒斑一端结合桥粒跨膜蛋白,另一端附着胞浆内中间丝(Intermediate Filaments, IF)。DSG2主要分布于表皮内中的基底细胞层、心肌及肠道等组织上皮,为“单层上皮型”。桥粒钙粘素DSG2具有经典钙粘素(E-cadherin)类似的功能,参与正常上皮细胞间粘附的调控。大量临床报道许多疾病伴随着桥粒钙粘素的异常表达,然而有关其异常表达的具体机制仍不清楚。文献报道桥粒钙粘素异常会导致桥粒连接功能异常,进而影响相应组织的结构以及功能完整性。在细胞内PKP3、JUP分别与DSG, DSC的胞内功能区结合,参与调节细胞间粘着及结合细胞骨架的功能,并对IF附着在桥粒起决定性作用。目的：利用蛋白组学技术初步探讨结直肠侧向发育型肿瘤的侧向发育生长机制。方法：通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)研究结直肠LSTs、隆起型腺瘤及正常大肠黏膜组织的超微结构,观察三者细胞间的连接方式,看是否找到与结直肠LSTs侧向生长发育相关的异常结构。应用western blot、免疫组化的方法验证桥粒家族蛋白DSG2、PKP3、JUP在结直肠LSTs,隆起型腺瘤及正常大肠组织中的表达。组间比较采用单向方差分析(One-way ANOVA)及后续的基于方差分析的多重比较方法(满足方差齐性时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法),P<0.05为差异有统计学意义。结果：透射电子显微镜(TEM)研究结直肠LSTs.隆起型腺瘤及正常大肠黏膜组织的超微结构,发现桥粒数量及密度在基底层、中间层表达正常,但在上皮侧,结直肠LSTs桥粒的数量及密度较隆起型腺瘤及正常大肠黏膜组织显著升高(P值分别为0.000,0.000),而且结直肠LSTs上皮侧桥粒的数量及密度最高。用Western blot、免疫组化的实验方法证实DSG2、PKP3及JUP的蛋白表达量在结直肠LSTs及隆起型腺瘤中较正常大肠黏膜组织显著升高(P值分别为0.000,0.000),且在结直肠LSTs中表达量最高。结论：DSG2、PKP3及JUP作为桥粒的重要组成部分,三者在结直肠LSTs的过表达证实了上皮侧桥粒数量及密度的增加可能导致结直肠LSTs侧向发育的生长方式。