背景和目的克罗恩病(Crohn’s disease, CD)是炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的一种主要类型,是一种病因不明的慢性肉芽肿性炎症性疾病。CD好发于回肠末端,空肠和上消化道少见,研究显示多达75%的CD病人有回肠末端炎症。回肠末端有两个明显的相关特征,即小肠在此部位的潘氏细胞数量和细菌浓度都是最高的,而且从近端小肠至远端小肠潘氏细胞数量和细菌浓度会越来越多。这些特征表明CD的发病同潘氏细胞和肠道菌群之间有着密不可分的关系。潘氏细胞在肠黏膜的固有免疫中起到了非常重要的作用,它不但同吸收肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞组成阻止肠道微生物入侵的防御性物理屏障,而且还通过分泌抗菌肽来维持肠道微生物和其宿主之间的肠道内稳态的平衡。关于CD的发病机制,主要观点认为减少的人类肠道抗菌肽不能有效清除肠道内微生物而导致肠道微生物同宿主之间的肠道内稳态紊乱,而这种紊乱的肠道内环境最终启动和维持了CD中的异常获得性免疫反应。人类肠道抗菌肽主要由肠道α-防御素及少量的溶菌酶(lysozyme)和分泌型磷脂酶A2(secretory phospholipase A2, sPLA2)组成。它们不仅对G-菌和G+菌有抗菌活性功能,而且对病毒、真菌和寄生虫也有一定的抗活性功能。人类肠道α-防御素有两种,即人类α-防御素5和6(human a-defensin 5和6,HD-5和HD-6),它们不但是人类肠道抗菌肽的主要组成成分,而且许多实验已经证实它们在肠道的固有免疫中起到了非常重要的作用。例如,转基因小鼠在促肠道α-防御素成熟的酶缺失后,它们不但容易被鼠伤寒沙门氏菌感染,而且它们的肠道微生物组成也会发生明显的改变,而HD5转基因小鼠则能增强他们的抗鼠伤寒沙门氏菌感染能力和有显著的肠内节丝状菌的缺失,而HD6转基因小鼠则能保护他们免受许多肠道病原菌的黏附侵入。白介素-23(Interleukin-23,IL-23)是一种由IL-23p19和IL-12p40组成的异二聚体类细胞因子。目前认为IL-23p19是IL-23特异的的组成亚单位,而IL-12p40还是IL-12的组成亚单位。在IL-23被认识之前,IL-12常被认为是肠道炎症反应中至关重要的细胞因子。但是近年来许多研究表明IL-23才是在肠道炎症反应中起着至关重要作用的细胞因子,例如,利用IL-23敲除小鼠进行的研究表明引起肠道内炎症因子联级反应的重要细胞因子是IL-23而不是IL-12,这类炎症因子主要包括IL-17、TNFα、IFNy和IL-6等；利用IBD病人肠道黏膜组织进行的研究表明IL-23通过启动两条重要的促炎通路参与IBD的发病,它们就是CD中的IL-23/Thl通路和UC中的IL-23/Th1 7通路；利用转基因小鼠进行的研究表明IL-23p19过表达会导致包括肠道在内的多器官的炎症发生；利用封闭性抗IL-23p19的单克隆抗体进行的研究表明封闭处理IL-23p19蛋白能显著改善小鼠因IL-10缺失引起的自发性肠炎和菌感染引起的Thl7细胞介导的结肠炎。这些研究表明在肠道炎症反应中IL-23p19起到了至关重要的作用。NOD2是第一个被认识的CD易感基因,研究表明在西方人群中超过50%的CD病人有NOD2突变体的存在。有研究表明在生理条件下潘氏细胞表达一定量的NOD2,而在CD这种病理条件下潘氏细胞过表达NOD2。也有研究表明这类细胞的IL-23p19基因表达也存在类似情况,即在生理条件下适度表达而在CD病理条件下过表达。目前还不清楚IL-23p19基因的这种类似的表达现象是否由于NOD2的表达异常而造成的。另有研究表明健康人回肠末段有一定量的抗菌肽表达,而在CD病人回肠末段抗菌肽的表达量减少,特别是α-防御素的表达量减少更明显,在NOD2有突变的CD病人中,此部位的α-防御素的表达量则进一步减少。尽管这些研究结果提示NOD2可能同人类肠道抗菌肽的表达有某种关系,但是目前人们对NOD2在人类肠道抗菌肽表达中具体作用的认知还非常有限。因为潘氏细胞在体外培养条件下不能存活,所以体外实验探讨潘氏细胞内NOD2功能时就有必要找到一种合适的替代细胞系。有研究显示Caco2肠上皮细胞在体外培养时有向小肠上皮分化的功能,这些研究表明这类细胞似乎有潜在的肠干细胞的功能。此外,这类细胞还表达丰富的纤维母细胞生长因子受体-3(fibroblast growth factor receptor-3,FGFR-3),已证实在肠道发展过程中这种受体对潘氏细胞的分化起到了关键的调节作用。更重要的是这类细胞还能表达一定量的NOD2。因此,它是一种比较合适的可替代潘氏细胞进行体外实验探讨NOD2功能的细胞。基于以上的研究背景,本研究有以下目的：1、活化FGFR-3介导的信号能否体外诱导Caco2细胞向潘氏细胞系分化。2、在潘氏细胞系分化过程中NOD2是否调节人类肠道抗菌肽的表达。3、研究NOD2调节肠道α-防御素表达的作用及机制。4、研究NOD2调节IL-23p19表达的作用及机制。方法1、用传代在15-30之间处于对数生长期的Caco2细胞进行实验。为了更好地模拟肠上皮细胞在体内肠道的空间位置条件,我们把Caco2细胞种植在置于六孔板内的悬挂式培养小室的PET膜上(3 μm pore size),这种膜允许培养基自由通过而进入膜的上下两边,而不允许细胞通过。2、为研究体外诱导Caco2细胞是否向潘氏细胞系分化,我们用10 ng/ml纤维母细胞生长因子9(fibroblast growth factor 9, FGF9)刺激Caco2细胞,FGF9是一种最有亲和力的FGFR-3配体。每24 h换一次刺激液体,连续刺激72 h后终止刺激并收集细胞进行实时定量PCR实验检测SI和APOA1这两种吸收肠上皮细胞分化特异基因的mRNA表达量和HD5、HD6、lysozyme和sPLA2这四种潘氏细胞分化特异基因的mRNA表达量。3、为研究NOD2是否调节人类肠道抗菌肽的表达,我们用10μg/ml胞壁酰二肽(muramyl dipeptide, MDP)刺激Caco2细胞,MDP是NOD2的配体；用10 ng/ml FGF9刺激Caco2细胞；用10 μg/ml MDP+10 ng/ml FGF9刺激Caco2细胞,每24 h换一次相同的刺激液体,连续刺激72 h后终止刺激并收集细胞进行实时定量PCR实验检测HD5、HD6、lysozyme和sPLA2这四种潘氏细胞分化特异基因,也是人类肠道抗菌肽基因的mRNA表达量。为进一步从反面证实NOD2在调节人类肠道抗菌肽表达中的作用,我们先向Caco2细胞转染NOD2-siRNA以敲低细胞内的NOD2蛋白,再分别用10 μg/ml MDP、10 ng/mlFGF9和10 μg/ml MDP+10 ng/ml FGF9刺激完成转染的细胞,每24 h换液一次,连续刺激72 h终止并收集细胞进行实时定量PCR实验检测HD5、HD6、 lysozyme和sPLA2的mRNA表达量和进行Western blot实验检测HD5和HD6的蛋白表达量。4、为研究诱导分化过程中NOD2的表达是否受到影响,我们用10 ng/mlFGF9刺激Caco2细胞,每24 h换一次刺激液体,分别于刺激24 h、48 h和72h后终止刺激并收集细胞进行Western blot实验检测NOD2的蛋白表达量。5、为研究诱导人类肠道α-防御素表达过程中可能参与的信号通路,我们分别用10 μg/ml MDP和10 ng/ml FGF9刺激Caco2细胞,每24 h换一次相同的刺激液体,连续刺激72 h终止刺激。而在最后一次24 h刺激前,我们先用5μM、10μM和50μM三种浓度的信号通路抑制剂,即NF-κB通路抑制剂BAY117082、PI3K通路抑制剂LY294002、MAPK信号通路的p38抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂U0126和JNK抑制剂SP600125处理细胞30 min,接着再用10 μg/ml MDP或10 ng/ml FGF9刺激细胞24 h后终止刺激并收集细胞进行实时定量PCR实验检测HD5和HD6的mRNA表达量。6、为研究主导人类肠道抗菌肽表达的信号通路的活化情况,我们用10ng/ml FGF9刺激Caco2细胞,分别于刺激10 min、30 min、60 min和120 min后收集细胞进行Western blot实验检测主导信号通路蛋白的磷酸化情况。7、为研究NF-κB通路哪种转录因子传到胞浆MDP-NOD2信号进胞核,我们用10 μg/ml MDP刺激Caco2细胞,分别于刺激2h、4h和6 h后终止刺激并收集细胞进行转录因子NF-κB活化量的检测实验。8、为得到类潘氏细胞,我们用10 ng/ml FGF9连续刺激Caco2细胞72 h,每24 h换一次刺激液体。这样处理得到的细胞用作类潘氏细胞,我们用这种类潘氏细胞来体外研究NOD2调节IL-23p19表达的作用及机制。9、为研究哪种肠道微生物成分诱导IL-23p19的表达,我们用各种工作浓度的TLRs配体,即10 μg/ml PGN、1 μg/ml Pam3CSK4,10 μg/ml Poly (I:C)、 10 μg/ml LPS,1μg/ml Flagellin,1μg/ml FSL-1、1μg/ml Imiquimod,1μg/ml ssRNA40和1μM MODN2006来刺激类潘氏细胞,分别于刺激4h、8h和16h后终止刺激并收集细胞进行实时定量PCR实验检测IL-23p19 mRNA的表达量。10、为研究NOD2是否调节TLR2介导的IL-23p19的表达,我们分别用10μg/ml MDP、10 μg/ml PGN、10μg/ml PGN+10 μg/ml MDP、1μg/ml Pam3CSK4和1 μg/ml Pam3CSK4+10μg/ml MDP刺激类潘氏细胞,于刺激4h后终止刺激并收集细胞进行实时定量PCR实验检测IL-23p19 mRNA的表达量。为了进一步从反面证实NOD2在调节TLR2介导的IL-23p19的表达中的作用,我们先用NOD2-siRNA敲低细胞内的NOD2蛋白,再用10 μg/ml PGN、1 μg/ml Pam3CSK4和1 μg/ml Pam3CSK4+10 μg/ml MDP分别刺激4h后收集细胞进行实时定量PCR实验检测IL-23p19 mRNA的表达量,在PGN刺激4h后还收集细胞进行Western blot实验检测IL-23p19蛋白的表达量。11、为了研究TLR2介导的IL-23p19表达主要涉及到哪些信号通路,我们先用五种工作浓度的信号通路抑制剂,即50 μM BAY117082 (NF-κB),50 μM LY294002 (PI3K),50μM SB203580 (p38),50 μM U0126 (ERK1/2), and 50μMSP600125 (JNK)预处理类潘氏细胞30 min,再用10μg/ml PGN刺激细胞4h后终止刺激并收集细胞进行实时定量PCR实验检测IL-23p19 mRNA的表达量。12、为研究主导IL-23p19表达的信号通路之活化情况,我们用10 μg/mlPGN刺激类潘氏细胞,分别于刺激5 min、10 min、30 min和60 min后收集细胞进行Western blot实验检测相关信号通路蛋白的磷酸化情况。13、为研究NF-κB通路哪种转录因子传导引起IL-23p19表达的胞浆信号进胞核,我们用1μg/ml Pam3CSK4和10μg/ml PGN刺激类潘氏细胞,于刺激2h后终止刺激并收集细胞进行转录因子NF-κB活化量的检测实验。14、为研究TLR2配体Pam3CSK4和PGN诱导IL-23p19表达差异的机制,我们用先用NOD2-siRNA敲低细胞内的NOD2蛋白,再用10μg/ml PGN刺激2h后收集细胞进行转录因子NF-κB活化量的检测实验。15、计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示。应用SPSS 18.0软件进行分析。两组间比较时采用Student’s t检验；多组间比较时采用单因素方差分析(one-way ANOVA),当满足方差齐性时,用Tukey法行组间多重比较,当方差不齐时,用Dunnett T3法行组间多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果1、在FGF9连续刺激Caco2细胞72小时后,同未处理组相比,处理组的SI和APOA1这两种吸收肠上皮细胞分化特异基因的mRNA表达量均显著减少且维持至少72小时。相反,处理组的四种潘氏细胞分化特异基因HD5、HD6、lysozyme和sPLA2的mRNA表达量却显著地增加并维持至少24小时。2、同仅用FGF9连续刺激细胞72小时相比,用FGF9+MDP连续刺激Caco2细胞72小时后,HD5、HD6、lysozyme和sPLA2的mRNA表达量分别减少约10.6倍、9.6倍、2.7倍和2.3倍。而在转染NOD2-siRNA后,FGF9刺激的转染细胞同未转染细胞相比,HD5、HD6、lysozyme和sPLA2的mRNA表达量均显著增加。同此结果相一致,FGF9刺激的转染细胞同未转染细胞相比,HD5和HD6蛋白表达量也都显著增加。3、在MDP连续刺激Caco2细胞72小时后,同未处理组相比,处理组的HD5和HD6基因的mRNA表达量分别增加约2.8倍和1.5倍,但是处理组的lysozyme和sPLA2基因的：mRNA表达量却没有显著性的改变。而在转染NOD2-siRNA后,MDP刺激的转染细胞同未转染细胞相比,HD5和HD6的mRNA表达量均显著减少。4、FGF9刺激组同未处理组间的NOD2蛋白表达并没有显著性的差异。5、MDP刺激的信号通路抑制剂预处理的细胞同未预处理的细胞相比,在用BAY117082预处理的细胞中HD5和HD6的mRNA表达量均减少最明显。而FGF9刺激的预处理细胞同未预处理的细胞相比,HD5和HD6的mRNA表达量分别在用SP600125和SB203580预处理的细胞中减少最明显。另外,FGF9刺激能引起Caco2细胞内MAPK通路中三种激酶p38、JNK和ERK1/2的磷酸化。6、在MDP刺激4小时和6小时后,胞核蛋白中p52,p50, Re1B和c-Rel的活化量都显著性增加,其中增加最明显的是p52和p50的活化量。7、TLR2激动剂PGN和Pam3CSK4均可以诱导类潘氏细胞的IL-23p19表达,当刺激处理4小时后,两者诱导的IL-23pl9 mRNA表达量最多,且此时PGN诱导的IL-23p19 mRNA表达量是Pam3CSK4诱导的四倍。此外,除了TLR2的激动剂PGN和Pam3CSK4外,其它的TLR激动剂并不能显著性诱导IL-23p19的表达。8、同PGN刺激细胞比,PGN+MDP刺激细胞的IL-23p19 mRNA表达量显著增加；同Pam3CSK4刺激组比,Pam3CSK4+MDP刺激组的IL-23p19mRNA表达量也显著增加。此外,单独用MDP刺激并不能显著性诱导IL-23p19的mRNA表达。而在转染NOD2-siRNA后,PGN或Pam3CSK4+MDP刺激的转染细胞同未转染组细胞相比,IL-23p19的mRNA表达量显著减少,而Pam3CSK4刺激的转染细胞同未转染细胞相比,IL-23p19的mRNA表达量并无显著性差异。另外,在Pam3CSK4刺激的未转染细胞同PGN刺激的转染细胞之间IL-23p19的mRNA表达量并无显著性差异。此外,PGN刺激的转染细胞同未转染细胞相比,IL-23p19的蛋白表达量显著减少。9、PGN刺激的用信号通路抑制剂预处理的细胞同未预处理的细胞相比,IL-23p19 mRNA表达量显著减少,而在用BAY117082预处理的细胞中IL-23p19 mRNA表达量减少最明显。此外,PGN还能引起IκBα的磷酸化。10、同未用任何刺激的对照组相比,NF-κB亚单位c-Rel的活化量在用PGN和Pam3CSK4刺激后均显著增加,而其它亚单位p65、p52、p50和RelB的活化量都没有显著性的差异改变。此外,同Pam3CSK4刺激组相比,PGN刺激组的c-Rel的活化量显著性增加。而在转染NOD2-siRNA后,PGN刺激的转染组同未转染组相比c-Rel的活化量显著性减少,而同Pam3CSK4刺激的未转染组相比c-Rel的活化量却没有显著性差异。结论1、活化FGFR-3介导的信号能体外诱导Caco2细胞向潘氏细胞系分化。2、在潘氏细胞系分化过程中NOD2下调人类肠道抗菌肽的表达。3、虽然仅活化NOD2本身能轻微上调人类肠道α-防御素的表达,但它却能显著下调FGFR-3介导的人类肠道α-防御素的表达。NOD2分别通过NF-κB通路和MAPK通路来上调和下调人类肠道α-防御素的表达。4、NOD2通过NF-κB亚单位c-Rel上调TLR2介导的IL-23p19的表达。