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中药抗炎药物的开发已经成为近几年来发展的重要方向，穿心莲内酯具有清热解毒，消炎退肿的作用，其结构改造的化合物穿琥宁也是目前临床上应用比较广泛的抗炎抗病毒药物，但由于其水溶性差，在体内代谢迅速，只能静脉滴注，而限制了其进一步的发展。CHP1002就是针对该药的这些缺点，以穿琥宁为母核，在侧链进行PEG修饰所得到的新化合物实体，不仅提高了水溶性，更增加了稳定性。本课题的研究目的是，评价CHP1002的抗炎镇痛疗效，探讨其体内作用方式和可能的作用机制。主要采用经典的小鼠耳肿胀和大鼠足肿胀模型以及小鼠醋酸扭体模型，比较CHP1002和原药穿琥宁在抗炎镇痛作用上的异同；在细胞和整体动物模型上考察CHP1002的代谢和跨膜转运情况；在细胞水平和分子水平探讨其抗炎机制。所获得的主要研究结果如下：一新化合物CHP1002抗炎镇痛作用及有效时间研究1. CHP1002抗小鼠耳肿胀实验：在二甲苯致小鼠耳肿胀模型上，CHP1002220mg/kg，440mg/kg，880mg/kg ip能剂量依赖地抑制二小鼠耳廓肿胀程度。在等剂量下CHP1002（440mg/kg）与原型药物穿琥宁（100mg/kg）比较，CHP1002的抗炎作用强度与穿琥宁相当（或略低），但有效时间明显长于穿琥宁。2. CHP1002抗大鼠足肿胀实验：用1%的λ-角叉菜胶致大鼠足肿胀模型，新化合物CHP1002（220mg/kg，440mg/kg，880mg/kg ip）也能在一定程度上抑制大鼠足趾肿胀。等剂量比较，CHP1002的作用强度与穿琥宁基本相同，但有效时间明显长于穿琥宁。3. CHP1002抑制小鼠醋酸扭体实验：在0.6%的醋酸溶液致小鼠扭体模型上，CHP1002（220mg/kg，440mg/kg，880mg/kg ip），能够剂量依赖性抑制小鼠醋扭体次数，证明CHP1002有明显镇痛作用。CHP1002（440mg/kg）与原型药物穿琥宁（100mg/kg）比较，镇痛作用强度略强于穿琥宁，镇痛有效时间约是穿琥宁的3倍。二CHP1002的动物药代动力学和跨膜吸收研究1. CHP1002在整体动物体内的代谢动力学测定：CHP1002（440mg/kg）和原型药穿琥宁（100mg/kg）分别在给药后的不同时间点采血，测其血中的穿琥宁含量。结果表明，穿琥宁注射后3min即可在血中检测到，达峰时间约7min，随后被迅速代谢，t1/2<30min。CHP1002注射后3min在血中也能检测到穿琥宁浓度，血药浓度缓慢上升，达峰时间约30min，但血药浓度Cmax仅为原药浓度的1/4，然后缓慢下降，t1/2约120min。该结果表明，CHP1002在动物体内能够解离出穿琥宁，可能具有前药效应，这与CHP1002的抗炎镇痛作用与原药穿琥宁相似，但有效时间延长的结果是一致的。2. CHP1002的跨膜转运试验：在Caco-2单层细胞转运模型上，CHP1002100μM与Caco-2细胞共孵育2h后，测得接收池内CHP1002的含量约4μM，提示CHP1002能够被部分转运，虽然透过的量较低（约为给药总量的4%），但能够达到μM水平，足以达到有效血药浓度。3. CHP1002在RAW264.7细胞上的透膜试验：RAW264.7细胞株是单核巨嗜细胞株，CHP1002和穿琥宁分别给予100μM，测其给药后不同时间点细胞内液和外液的CHP1002和穿琥宁的含量。结果表明，穿琥宁能够透过细胞膜，胞内穿琥宁浓度随着给药时间延长而逐渐增加；CHP1002给药后细胞内既不能检测到CHP1002大分子，也检测不到穿琥宁小分子。该结果提示，CHP1002在细胞培养液中较稳定，几乎不能降解释放出穿琥宁，大分子CHP1002也不能直接透过细胞膜进入细胞。三CHP1002抗炎作用的机制研究1. CHP1002和穿琥宁对炎症因子表达和释放的影响：在RAW264.7细胞株上，用免疫印迹方法检测iNOS和COX-2表达，用硝酸还原酶法和ELISA法检测NO和PGE2含量。结果表明，CHP1002和穿琥宁都能够抑制iNOS和COX-2表达，减少NO和PGE2的产生，这与CHP1002抗炎镇痛作用机制有关。2.采用IN Cell Analyzer2000细胞蛋白核转位荧光成像分析系统（NuclearTraffickingAnalysis Module），对NFκB通路相关受体进行分析检测。在组成型表达EGFP-NFκB p65融合蛋白的CHO细胞上和组成型表达GFP-MAPKAPk2融合蛋白的BHK细胞上，观察到CHP1002和PEG1000不能抑制经IL-1β、TNF-α诱导的NF-κB p65和LPS诱导的MAPKAPk2的核转位，穿琥宁也不能抑制IL-1β诱导的NFκB p65核转位和LPS诱导的MAPKAPk2核转位，但能部分抑制TNF-α诱导的NFκB p65核转位，其抑制率约20%，且没有量效关系。结果提示，CHP1002的抗炎镇痛作用可能不是通过IL-1β、TNF-α和LPS受体介导。3. CHP1002和穿琥宁对HO-1蛋白表达的影响：在RAW264.7细胞上，用免疫印迹方法检测发现，穿琥宁能够诱导HO-1表达增加， CHP1002也能够诱导HO-1表达，并具有剂量依赖性和时效性。HO-1活性特异拮抗ZnPP能够部分翻转CHP1002和穿琥宁对iNOS、COX-2表达的抑制作用，也能对抗CHP1002和穿琥宁对NO、PGE2产生的抑制作用。提示，CHP1002和穿琥宁的抗炎镇痛作用机制可能与HO-1信号系统有关。4. CHP1002对Nrf2通路的影响：在RAW264.7细胞上，采用免疫印迹方法观察CHP1002对Nrf2表达和核转位及对ERK磷酸化的影响。结果显示，CHP1002能够诱导Nrf2的表达和核转位，并促进ERK的磷酸化。ERK磷酸化特异性抑制剂U0126明显抑制CHP1002诱导HO-1表达和Nrf2核转位。提示，HO-1信号通路与Nrf2核转位及ERK激酶磷酸化密切相关。综合以上研究成果，本研究的创新点有以下四方面：1确定了CHP1002抗炎镇痛的作用特点，与PEG修饰的化合物基本一致。2用细胞和整体动物模型初步证明，CHP1002可以跨膜转运，也可以在动物体内解离释放出穿琥宁，呈现出前药效应。提出CHP1002大分子与穿琥宁小分子都是作用实体，PK/PD分析结果支持这一结论。3作用机制分析首次证明，CHP1002不能穿透细胞膜，其作用靶标可能在膜上，不能直接作用于NFκB通路，HO-1信号通路可是主要机制之一4首次发现穿琥宁不通过IL-1β、TNF-α和LPS受体介导抑制NFκB通路活性，抗炎作用可能与HO-1信号通路有关。