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第一部分MUC5AC靶向分子探针构建及性能表征目的:合成聚乙二醇修饰的磁性纳米颗粒PEG·SPIONs,对该纳米颗粒性质进行性能表征,再构建基于MUC5AC磁性及荧光双模态成像探针FITC-anti-MUC5AC-PEG·SPIONs。材料与方法:1、PEGSPIONs的合成:将0.7g乙酰丙酮铁、6g聚乙二醇、25ml三甘醇(TEG)三种物质置于100ml的三口瓶中,并在氩气保护下磁力搅拌将其混合均匀。缓慢升温,保证其升温速度为5℃/min,加热到温度为210℃反应2h,然后继续升温至287℃反应1h。反应结束后,停止加热缓慢降至室温后,停止通气。将产物置于0.1%的柠檬酸钠和乙醇中分别透析3次(1天),重悬于Buffer溶液(pH8.2)中,4℃保存备用。2、anti-MUC5AC-PEG·SPIONs 的构建:1)100ul 的 PEG·SPIONs(16.5uM)加入200ul 的 Buffer 溶液(pH=8.2)中混匀,再加入 15ug 的 anti-MUC5AC;2)取8.0mgEDC/NHS溶于500ul的去离子水中,用移液枪准确量取12ul加入上述溶液;3)机械旋转2h后,用高速离心机离心(1X104r/min,15min),最后重悬于保存液中,4℃避光保存。3、FITC-anti-MUC5AC-PEGSPIONs 的构建:称取 0.6mgFITC,溶于 100ul 微升DMSO 中,再加入到 7.11uM(100ul)的 anti-MUC5AC-PEG·SPIONs,避光机械旋转24h后,需用去离子水透析5次(间隔4小时),得到FITC-anti-MUC5AC-PEG·SPION,整个过程需严格避光。4、采用透射电镜(TEM)观察PEGSPIONs纳米粒子的形态及核心粒径;通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)法分析PEG·SPIONs的表面基团;X射线电子衍射(XRD)、振动样品磁强计(VSM)、磁共振成像等测量PEG·SPIONs的磁学性质。荧光光谱仪分析 FITC-anti-MUC5AC-PEGSPIONs 的光学特性。结果:TEM显示PEG·SPIONs核心粒径在11.7nm左右,有较好的分散性;XRD显示PEG ·SPIONs纳米微粒衍射谱三强峰与标准的Fe304PDF卡片(JCPDS 11-0614)基本吻合,结晶性较好;振动样品磁强计(VVSM):磁性分析显示PEG·SPIONs余磁为0,为超顺磁性材料,其饱和的磁化强度分别为29.9 emu/g,适合作为MR成像的对比剂;傅立叶红外(FTIR)结果表明PEG成功包覆在Fe304表面;体外弛豫曲线:在室温条件下,r1和r2的值分别为35.92mM/s,206.91mM/s,相应的r2/r1的比值为5.76,适合用于T2成像;体外MR成像:随着PEG·SPIOs浓度的增加,T2加权成像信号逐渐减弱。FITC-anti-MUC5AC-PEG·SPIONs发射峰约为520nm,呈现明亮的黄绿色荧光。结论:双模态探针FITC-anti-MUC5AC-PEG·SPIONs具有粒径小、磁学参数理想,胶体稳定性好,光学特性稳定佳;体外实验结果显示该探针在T2WI上为低信号,提示该分子探针可能是一个理想的MR分子探针。第二部分MUC5AC分子探针靶向胰腺癌细胞的实验研究目的:通过PEGSPIONs与胰腺癌细胞系SW1990及小鼠成纤维细胞系3T3共同孵育的方法评价探针的毒性和体内药物代谢动力学试验。研究探针FITC-anti-MUC5AC-PEG·SPIONs体外成像能力及靶向能力。材料及方法:1、采用二甲基四氮唑法(MTT法)测PEG·SPIONs对细胞活力的影响,设置小鼠成纤维细胞3T3细胞作为对照组;2、将 PEGSPIONs、Anti-MUC5AC-PEG·SPIONs(16.5uM)两种纳米颗粒分别与胰腺癌细胞SW1990共同孵育24h后,后分别收集细胞。(1)通过普鲁士蓝染色定性观察细胞对这两种纳米颗粒的吞噬情况;(2)将各组细胞溶于1mL浓硝酸溶液中,60℃加热30分钟,后取100uL稀释1mL倍,送于ICP测定Fe元素含量。3、激光共聚焦显微镜成像分析:将SW1990细胞分别与PEGSPIONs、FITC-anti-MUC5AC-PEG·SPIONs 共孵育 15min 后,PBS 清洗 2-3 次去除漂浮纳米颗粒,最后置于激光共聚焦显微镜拍摄细胞染色图像。4、药物代谢与组织分布:Kunming小鼠经尾静脉注入2.5mg/Kg的PEGSPIONs分别在注射后6h、12h、24h、48h、7d、14d,于在各时间点分别处死3只裸鼠,取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠组织进行HE染色、Fe含量的检测。对照组设3只未注射PEGSPIONs的小鼠。结果:MTT示在PEGSPIONs孵育浓度达192uM下,SW1990和小鼠成纤维细胞3T3保持80%以上的活力,证明PEG·SPIONs细胞毒性低;普鲁士蓝染色显示孵育anti-MUC5AC-PEGSPIONs靶向探针的胰腺癌细胞内有大量的蓝色铁颗粒分布,而孵育PEGSPIONs的癌细胞组内有少量见到蓝色颗粒;荧光结果进一步显示孵育FITC-anti-MUC5AC-PEG·SPIONs靶向探针的胰腺癌细胞内有大量荧光分布。两者共同说明该靶向探针纳米颗粒能够有效的转染胰腺癌SW1990细胞。铁含量分析结果显示anti-MUC5AC-PEGSPIONs高;而PEGSPIONs组较低。药物代谢和组织学分布结果显示,PEGSPIONs主要由肝、脾、肠吸收代谢,首先主要由网状内皮系统摄取,并在14天内经由肝胆管系统排泄和降解,并未对重要组织脏器(心、肝、脾、肺、肾、肠)未见明显的组织学改变。结论:MUC5AC分子探针生物毒性低,能高效的转染胰腺癌SW1990细胞,激光共聚焦结果显示该探针能够靶向穿过细胞膜进入细胞内,癌细胞特异富集,细胞内荧光稳定,因此,本实验制备的探针FITC-Anti-MUC5AC-PEG·SPIONs是一个良好的特异性靶向胰腺癌分子探针。