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目的本文旨在探讨一种新型Wnt替代蛋白(Wnt surrogate,Wnt-S)对大脑中多种细胞Wnt/β-catenin信号通路的作用,以及可能治疗脑卒中的一种新的策略。方法合成Wnt-S片段,利用分子克隆的方法将此片段与载体pcDNA3.1(+)连接,再与大肠杆菌作转化,铺平板,挑单克隆,摇菌提取质粒,用PEI转染法将质粒与HEK 293F细胞进行瞬时转染,取上清然后纯化Wnt-S蛋白,蛋白免疫印迹(Western blot)检测含6x His标签的Wnt-S蛋白,并在HEK 293细胞中进行活性验证。培养HEK 293,hCMEC/D3,HBVP,HA,HOC,NSC,BV2,Neuron,采用免疫荧光染色的方法分别检测这些细胞特异的标志物,实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)分别检测这些细胞中受体FZD1-10(Frizzled家族)、LRP5/6以及相应标志物的表达情况。用Wnt-S蛋白分别处理这些细胞,实时荧光定量PCR检测Wnt/β-catenin信号通路靶基因Axin2的表达情况。小鼠脑定位SGZ区注入Wnt-S腺病毒,检测神经干细胞的增殖情况。结果1、在HEK 293细胞中,Wnt-S蛋白能激活Wnt/β-catenin信号通路,并随Wnt-S蛋白浓度的增大,Wnt/β-catenin信号通路靶基因Axin2表达逐渐升高。2、在人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3)中,Wnt/β-catenin信号通路在低浓度的Wnt-S蛋白(≤1000ng/ml)条件下不能显著激活,而在高浓度的Wnt-S蛋白(≥1500 ng/ml)条件下能显著激活,且随Wnt-S蛋白浓度的增加,Axin2表达逐渐升高。3、在人脑血管周细胞(HBVP),人星形胶质细胞(HA),人少突胶质细胞(HOC),小鼠神经干细胞(NSC),大鼠神经元细胞(Neuron)中,随Wnt-S蛋白浓度的增加,Axin2出现先升高后降低的趋势。4、在小鼠小胶质细胞(BV2)中,Wnt-S蛋白不能显著上调Axin2的表达。5、在小鼠大脑中,Wnt-S能显著促进神经干细胞的增殖。结论1、纯化的Wnt-S蛋白具有生物活性。2、在体外实验中,Wnt-S蛋白能激活hCMEC/D3,HBVP,HA,HOC,NSC,Neuron中的Wnt/β-catenin信号通路,但对BV2不起作用。3、在体内实验中,Wnt-S能显著促进小鼠大脑中神经干细胞的增殖。