研究背景与意义大肠癌(colorectal cancer, CRC)是指大肠粘膜上皮在遗传或环境等多种致癌因素的影响下发生的恶性病变。大肠癌作为最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率较高。近年来,由于对恶性肿瘤的发病机制研究越来越多,在西方国家以及北美等发达国家中,大肠癌患者的生存期及生活质量有了较大提高,但是在我国,大肠癌的发病率和死亡率仍然在持续增加。目前大肠癌的发病机制仍不清楚,根据目前资料分析,大肠慢性炎症、大肠腺瘤、遗传以及高脂肪高蛋白饮食与大肠癌的发病率明显相关,而吸烟、环境因素(如土壤中缺钼)、血吸虫病、盆腔放射等多种致病原因也可以促进大肠癌的发病。早期诊断,早期治疗是治疗任何恶性肿瘤的关键,但是大肠癌患者早期症状不明显,一旦发现,将近一半的患者已发生了远处脏器转移,如肝转移等。电子肠镜检查在大肠癌的早期诊断中具有重要价值,但是由于是侵入性操作,具体普及起来患者依从性较差。因此,早期诊断、早期治疗对于大肠癌十分困难。并且,即使大肠癌患者手术前没有发生远处转移,也有超过1/3的病人会出现复发情况,因此有效的早期诊疗尤为重要。肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤的复杂过程,基因的突变和异常表达在肿瘤的发生和发展中具有重要作用。近年来,随着对大肠癌发生相关癌基因、抑癌基因及其影响因素等认识的深入,DNA甲基化修饰、非编码RNA、组蛋白修饰以及染色质重塑等表观遗传学因素在大肠癌的发生、发展过程中的作用越来越受到人们的重视。长链非编码RNA (Long non-coding RNA, LncRNA)是长度在200-100,000 nt之间的分子,其不具有编码蛋白的能力,而是以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等各种方面对基因的表达进行调节。近期报道均提示lncRNA在正常组织与肿瘤组织中的表达存在显著差异,肿瘤中异常表达的lncRNA成为肿瘤诊断和判断预后以及治疗效果的一个重要的标志物。随着研究的深入,提示incRNA可能通过多种方式来参与恶性肿瘤的发生发展,例如染色质重构、调节DNA甲基化、组蛋白修饰和作为miRNA的前体等。目前,随着IncRNA研究的深入,关于IncRNA在大肠癌中的报道越来越多。如Zheng等研究显示lncRNA MALAT1在大肠癌组织中高表达,其高表达与肿瘤患者的整体存活期及无病存活期密切相关,提示lncRNA MALAT1能够作为大肠癌整体存活期及无病存活期的预测因子。Yin等研究显示,IncRNA GAS5在大肠癌中低表达,且与大肠癌的肿瘤大小、组织学分级及TNM分期密切相关,进一步实验显示IncRNA GAS5能够抑制大肠癌的增殖与侵袭能力。Chen等研究发现,IncRNA FEZF1-AS 1的失调能够参与大肠癌的发生与发展(增殖、迁移、侵袭等),其致癌过程通过诱导FEZF1实现。Xiang等研究显示,IncRNA CCAT1-L位于大肠癌MYC基因上游,起着MYC转录调控的作用,同时能够促进远距离染色质循环。而DANCR作为IncRNA家族重要成员之一,在大肠癌中的表达以及对大肠癌发生、发展的作用仍不清楚。LncRNA DANCR是近期发现的一类IncRNA,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。Yuan等最早在肝癌中发现IncRNA DANCR,其在干细胞样HCC细胞中过表达,并且这可以作为HCC患者的预后生物标志物,IncRNA DANCR能够增加肝癌细胞的干细胞特性,促进肿瘤发生和肝内/外肿瘤定植。相反,低表达IncRNA DANCR能够降低其干细胞特性,并能够导致肿瘤细胞的活力降低,肿瘤体积缩小等。进一步研究发现IncRNA DANCR是通过抑制CTNNB1来增加肝癌干细胞特性。Zhang等研究显示Sox4能够通过激活IncRNA DANCR从而增强软骨细胞的分化和滑膜源性干细胞的增殖。Chen等研究结果显示,IncRNA DANCR能够通过抑制Wnt/β-catenin的途径抑制人牙髓细胞的成牙本质样细胞分化。Tong等人发现IncRNA DANCR在人类循环单核细胞中可以作为绝经后骨质疏松相关的生物标志物。目前有关IncRNA DANCR在肿瘤中的研究仍然较少,并且没有关于IncRNA DANCR与大肠癌的报道。因此,研究IncRNA DANCR在大肠癌中的表达及其功能具有临床和预后价值。本课题进行了以下3部分的研究：(1)采用定量PCR方法检测了104例大肠癌组织、癌旁组织以及大肠癌细胞系SW480、HCT116、LS174T. CaCo、SW620、SW1116、HT-29和LoVo中lncRNA-DANCR的表达情况,分析其表达和大肠癌各个临床病理特征的相关性,并评价lncRNA对大肠癌患者的预后意义；(2)分别构建lncRNA-DANCR过表达以及低表达的大肠癌细胞株,通过CCK8实验、细胞凋亡实验、细胞周期实验以及迁移和侵袭实验进一步研究lncRNA DANCR在大肠癌中的生物学功能。(3)结合文献资料,探寻lncRNA-DANCR在大肠癌细胞内诱导的下游信号途径,体外实验验证lncRNA-DANCR诱导ERK/MAPK途径的活化对细胞增殖、侵袭能力产生影响,从而明确lncRNA-DANCR促进大肠癌生长和侵袭的信号机制。第一部分lncRNA DANCR在大肠癌中的表达及其预后意义研究目的通过对大肠癌临床标本中lncRNA DANCR的表达水平进行检测,探讨lncRNA DANCR的表达与大肠癌患者临床病理特征的相关性及其预后意义。研究方法收集山东大学齐鲁医院2007-2008年行根治性切除(R0)的104例大肠癌患者的组织标本及其匹配的癌旁正常组织标本,应用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测lncRNA DANCR表达水平并统计患者临床资料；qRT-PCR检测lncRNA DANCR在大肠癌细胞株中的表达水平。应用Fisher精确概率法分析lncRNA DANCR表达和临床病理特征的相关性,Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,多因素Cox比例回归模型来评价各个指标的预后意义。研究结果qRT-PCR结果显示大肠癌患者肿瘤标本中的lncRNA DANCR表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。且lncRNA DANCR在SW480、HCT116、LS174T、CaCo、SW620、 SW1116、HT29和LoVo等大肠癌细胞系中的表达明显增高。相关性分析结果显示lncRNA DANCR与大肠癌的组织分化程度、淋巴结转移以及肿瘤TNM分期显著性相关(P<0.05),但是与患者性别、年龄、肿瘤大小以及局部浸润无明显相关性(P>0.05)Kaplan-Meier分析显示lncRNA DANCR高表达组病人的整体存活期(overall survival,OS)及无病存活期(disease-free survival, DFS)明显低于lncRNA DANCR低表达组,差异具有显著性(P<0.05)。多因素Cox比例回归模型分析结果显示lncRNA DANCR可以作为大肠癌患者OS和DFS的独立预测因子。研究结论lncRNA DANCR在大肠癌中高表达,且lncRNA DANCR与肿瘤的组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期及大肠癌患者预后显著相关,提示其lncRNA DANCR在大肠癌发生发展中发挥重要作用,具有成为大肠癌患者早期诊断和治疗的潜在靶点的临床价值。第二部分lncRNA DANCR对大肠癌细胞生物学特性的影响研究目的探讨lncRNA DANCR对大肠癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学行为的影响。研究方法构建DANCR低表达载体si-DANCR以及过表达载体pcDNA-DANCR,分别转染大肠癌细胞株HT29和SW480。应用qRT-PCR检测大肠癌细胞中lncRNA DANCR表达水平并评估其转染效果,CCK8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,划痕实验检测大肠癌细胞体外迁移能力,Matrigel侵袭实验分析大肠癌细胞体外侵袭能力。研究结果qRT-PCR结果显示si-DANCR以及pcDNA-DANCR能够有效的促使大肠癌细胞株HT29和SW480分别低表达和高表达lncRNA DANCR. CCK8实验结果显示降低lncRNA DANCR表达能够抑制大肠癌细胞HT29和SW480的增殖能力(P<0.05)；与此相反,过表达lncRNA DANCR能够促进大肠癌细胞HT29和SW480的增殖(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示lncRNA DANCR沉默组细胞中的GO/G1期细胞比例明显增高,而过表达lncRNA DANCR的大肠癌细胞HT29和SW480中其GO/G1期细胞比例明显降低,而S期的比例明显增高(P<0.05)。细胞凋亡实验结果表明,与对照组相比低表达lncRNA DANCR能够促进大肠癌细胞HT29和SW480的凋亡,而过表达lncRNA DANCR能够抑制大肠癌细胞的凋亡(P<0.05)。划痕实验及Matrigel侵袭实验结果显示低表达lncRNA DANCR后大肠癌细胞HT29和SW480的迁移和侵袭能力明显降低,而lncRNA DANCR过表达后大肠癌细胞HT29和SW480的迁移和侵袭能力明显增高(P<0.05)。研究结论lncRNA DANCR能够明显促进大肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力以及抑制其凋亡。第三部分lncRNA DANCR通过调控下游MAPK通路影响大肠癌细胞增殖和侵袭能力研究目的探寻lncRNA DANCR促进大肠癌增殖及侵袭的相关信号途径。研究方法DANCR靶基因的预测、验证及功能研究：结合基因定位分析、生物信息预测及文献,推测ZAK可能是DANCR的潜在靶点之一；qRT-PCR检测ZAK在大肠癌组织中的表达情况,利用qRT-PCR和Western blot验证DANCR与ZAK之间的表达关系；HT29细胞分别转染si-DANCR, si-ZAK.共转染si-ZAK与si-DANCR,利用CCK8及Western blot等方法探索DANCR是否通过ZAK发挥作用。进一步利用Western blot检测MAPK通路重要蛋白的活化水平。研究结果基因定位分析发现ZAK位于DANCR基因附近,提示DANCR可能以cis-acting作用方式调控其表达；qRT-PCR发现ZAK在大肠癌组织中显著低表达,且大肠癌组织中DANCR与ZAK表达呈负相关,DANCR表达抑制后,ZAK在mRNA和蛋白水平表达均上调,提示ZAK可能是DANCR作用的潜在靶基因,且DANCR通过负调控ZAK表达发挥作用。CCK8实验提示降低DANCR的表达对大肠癌细胞增殖抑制作用可以部分被ZAK表达下调所削弱。进一步Western blot显示DANCR表达下调后ERK1/2>JNK及p38的磷酸化水平显著下调,同si-DANCR组相比,si-DANCR和si-ZAK共转染组,明显增高了ERK1/2、JNK及p38的磷酸化水平,但低于si-ZAK组,说明下调DANCR表达可促进ZAK表达使MAPK通路失活。研究结论DANCR通过负调控靶基因ZAK表达,并使下游MAPK通路激活进而促进大肠癌细胞增殖及侵袭能力。因此,大肠癌中可能存在DANCR-ZAK-MAPK的调控机制,通过影响细胞增殖与侵袭促进大肠癌的发生发展,为日后深入研究大肠癌分子机制及临床分子治疗提供新思路。