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苹果树腐烂病是由弱寄生子囊菌苹果黑腐皮壳(Valsa mali Miyabe&Yamada)侵染引起的一种枝干病害,在我国分布广危害重,造成了巨大的经济损失,是生产上的重大灾害和重点防治对象。病菌一旦侵入苹果树的韧皮部和木质部,化学药剂难以防控,同时传统的病斑刮治技术等造成了树体二次伤害,加之,农药残留、环境污染、病原菌的耐药性问题日益凸显以及抗病品种缺乏,开发一种新型、高效、绿色的防控病害方式成为当务之急。生物防治作为一种有效的、环境友好型的防控策略引起了人们的广泛关注。其中芽孢杆菌(Bacillus)由于能够产生多种抗菌活性物质,并且不易受外界环境条件的影响,被认为是理想的生防菌剂(Biocontrol agents,BCAs)。本研究基于课题组前期关于芽孢杆菌EDR2和EM7对苹果树腐烂病菌均有强烈的抑制作用基础上,通过明确两株拮抗菌株中关键的拮抗活性相关基因及抗菌物质,为后期把两株拮抗菌株改造成为工程菌株提供材料及技术依据,进而为苹果树腐烂病的防控提供新思路。主要结果如下:1.拮抗菌株EDR2的鉴定、抗菌物质种类分析及与菌株EM7的比较:通过形态观察、生理生化特征及分子鉴定,拮抗菌株EDR2被初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。利用TCA沉淀法将拮抗菌株EDR2发酵液中的蛋白充分沉淀后,发现等量的发酵液与除菌滤液的抑菌活性无显著差异(P<0.05),而去除蛋白上清液完全没有活性,明确了EDR2的主要抗菌物质是抗菌蛋白。抑菌谱测定结果表明,拮抗菌株EDR2和EM7对供试的靶标真菌均有不同程度的拮抗活性,但是对于同一种靶标真菌,两株拮抗菌株的拮抗活性差异显著。抗逆性测定显示,在pH5-10和NaCl含量1%-9%逆境条件下,EDR2和EM7都能生长,但菌落形态有显著差异。2.拮抗菌株EDR2和EM7的遗传转化体系的建立和抑菌活性显著变化突变体的筛选:通过转座子插入技术构建了拮抗菌株EDR2和EM7的突变体库,分别获得突变体5256株,413株。以苹果树腐烂病菌强致病力野生型菌株03-8为筛选靶标,通过平板对峙法从EDR2突变体库中筛选到21株抑菌活性显著降低的突变体,占整个突变体库的0.4%;从EM7突变体库中筛选到1株抑菌活性显著降低的突变体EM-217,占整个突变体库的0.24%;没有筛选到抑菌活性显著增强的突变体。PCR扩增和Southern杂交结果表明筛选出的22株突变体全部是转座子TnYLB随机插入EDR2或EM7基因组所得,其中20株突变体是转座子单拷贝插入突变,占筛选突变体的91%,只有突变体ED-1806是双拷贝插入突变,ED-1818是四拷贝插入突变。3.菌株EDR2和EM7拮抗活性相关基因的鉴定:通过SiteFinding-PCR方法共扩增获得18个转座子插入突变的基因序列。结合基因序列比对、突变体的菌落形态和生长曲线,对18个插入突变基因进行功能分析,结果表明其中6个基因(putative oxidoreductase,3-oxo-acyl-ACP reductase Dlt E,putative nucleoside 2-deoxyribosyl transferase,istone arginine demethylase JMJD6,3-oxoacyl-ACP reductase DltE,Beta-ketoacyl synthasemannose-6-phosphate isomerase)通过影响菌株的生长或者细胞膜的结构,间接的影响了拮抗活性;3个已知基因(Thioesterase II-like protein,Endo-β-1,3-1,4-glucanase和putative chitin binding protein)与拮抗活性直接相关相关;另外8个基因(hypothetical protein)功能未知。最后利用基因敲除技术对8个未知功能的基因敲除后发现,其中有5个基因对菌株EDR2的拮抗活性有显著性影响,可能是潜在的新的抑菌活性相关基因。4.拮抗活性相关基因的外源表达和抗菌蛋白的获得:首先以pET32a(+)为载体,构建了8个拮抗活性相关基因的原核表达载体和重组菌株,SDS-PAGE电泳检测到3个基因(hypothetical protein(ED-2500),putative chitin binding protein和β-1,3-1,4-glucanase)显著表达。对诱导表达的重组菌株培养物进行超声破壁,分别对离心获得的蛋白上清液和沉淀进行检测,结果表明只有β-1,3-1,4-glucanase基因编码的重组蛋白Glu-His在上清液中能检测到,而其他两个重组蛋白仅在沉淀中检测到包涵体。拮抗活性检测和稳定性检测发现纯化获得的重组蛋白Glu-His是一种耐热、耐酸的抗菌蛋白,该特性与菌株EM7发酵液蛋白粗提物的性质类似。因此认为β-1,3-1,4葡聚糖酶是拮抗菌株EM7的重要拮抗物质之一,β-1,3-1,4-glucanase基因是菌株EM7中重要的拮抗活性相关基因。5.拮抗菌株EDR2及其突变体胞外蛋白的差异分析:利用TCA-丙酮法提取菌株EDR2及其5株突变体的胞外蛋白,结合双向电泳技术及PQuest 8.0 2D Analysis软件,选取突变体中缺失的差异蛋白点17个,下调表达的差异蛋白点20个,进行质谱鉴定共计得到33个差异蛋白点。对其中2个差异蛋白成功进行了外源表达、重组蛋白纯化和拮抗活性测定,证明重组蛋白AP-His对苹果树腐烂病菌有较强的抑菌活性,是重要的抗菌蛋白之一;而重组蛋白UP-His的拮抗活性较弱,但是,基因敲除试验结果则证明该基因的缺失显著的影响了菌株EDR2的拮抗活性,推测该基因通过间接方式影响菌株的拮抗活性。