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胰蛋白酶(EC3.4.21.4)属于丝氨酸蛋白酶家族。在脊椎动物中作为消化酶而起作用。动物胰蛋白酶主要来源于其胰脏、肠道和幽门盲囊。胰蛋白酶在胰腺中合成并以非活性的酶原形式分泌到消化道中,在消化道中酶原通过除去部分肽链转变成有活性的形式,来行使其消化功能。
胰蛋白酶在食品工业、制药业、纺织业、生物技术等领域具有广泛的应用,然而蛋白酶稳定性较差,在工业生产中受到严重限制。为此,作者开展了胰蛋白酶化学修饰的研究,以期得到满足工业生产中的高温及酸碱条件的修饰酶。本研究首先从胭脂鱼肝胰脏分离纯化出胰蛋白酶纯品。再用活化的右旋糖苷为修饰剂,对其进行共价修饰。通过实验筛选出最佳的修饰反应条件,并对胰蛋白酶在修饰前后的主要酶学性质进行了比较研究。
1.胭脂鱼胰蛋白酶的纯化
将胭脂鱼断脊处死并将其肝胰脏取出,双蒸水淋洗沥干,加入五倍体积的含Ca2+Tris-HCl缓冲液匀浆,过夜激活,冷冻离心弃沉淀。20-80%硫酸铵分级沉淀,离心取沉淀并用Tris-HCl缓冲液溶解,透析24h。用HiTrapBenzamidineFF(highsub)亲和预装柱纯化,以pH3.0的甘氨酸-HCl为洗脱液,收集蛋白峰并做活性检测,调节洗脱峰蛋白溶液至pH9.0。将收集得到的具有胰蛋白酶活性酶液进行离子交换,采用DEAE-SepharoseTMFastFlow(1.2×20cm)为填料,用2MNaCl溶液与Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰并作活性检测。测定每步纯化后所收集酶液的蛋白质含量和胰蛋白酶活性并计算产率和纯化倍数,结果显示胭脂鱼胰蛋白酶的最终的产率为8%,纯化倍数达到了185.3倍。
2.胭脂鱼胰蛋白酶的化学修饰
以高碘酸钠氧化活化的右旋糖苷T-70对已纯化的胰蛋白酶进行修饰,在不同的反应条件下得到不同修饰率的胰蛋白酶,优化修饰条件后得到较高修饰率和酶活保留的修饰产物,即高碘酸钠与右旋糖苷的比例为1∶1,活化后的右旋糖苷与胰蛋白酶的比例为5∶1,活化反应最适pH为6,最终酶保留活力53%,修饰率为87%。
3.修饰前后胰蛋白酶性质的比较
采用SDS-PAGE电泳法测定修饰前后的分子量变化,得到纯化的胭脂鱼胰蛋白酶呈现出单一条带,其分子量大约为26KDa。修饰酶经纯化后在分子量约为66KDa处呈一条主带,但下有小分子量的弥散带。修饰前后胰蛋白酶的动力学常数(Km)测定以BANPA为底物,采用双倒数作图法,测得结果分别为0.074mM、0.21mM。
对修饰酶和自然酶的最适温度、最适pH、酸碱稳定性、酶促反应动力学、热失活动力学进行了分析。结果显示自然酶最适温度为60℃,最适pH为8.5,修饰反应并没有改变酶的最适温度和最适pH,酸碱稳定性修饰前后大致趋势一致。酶促反应动力学表明修饰酶的催化效率低于原酶,主要原因是修饰酶的底物亲和力1/Km下降。
胰蛋白酶在食品工业、制药业、纺织业、生物技术等领域具有广泛的应用,然而蛋白酶稳定性较差,在工业生产中受到严重限制。为此,作者开展了胰蛋白酶化学修饰的研究,以期得到满足工业生产中的高温及酸碱条件的修饰酶。本研究首先从胭脂鱼肝胰脏分离纯化出胰蛋白酶纯品。再用活化的右旋糖苷为修饰剂,对其进行共价修饰。通过实验筛选出最佳的修饰反应条件,并对胰蛋白酶在修饰前后的主要酶学性质进行了比较研究。
1.胭脂鱼胰蛋白酶的纯化
将胭脂鱼断脊处死并将其肝胰脏取出,双蒸水淋洗沥干,加入五倍体积的含Ca2+Tris-HCl缓冲液匀浆,过夜激活,冷冻离心弃沉淀。20-80%硫酸铵分级沉淀,离心取沉淀并用Tris-HCl缓冲液溶解,透析24h。用HiTrapBenzamidineFF(highsub)亲和预装柱纯化,以pH3.0的甘氨酸-HCl为洗脱液,收集蛋白峰并做活性检测,调节洗脱峰蛋白溶液至pH9.0。将收集得到的具有胰蛋白酶活性酶液进行离子交换,采用DEAE-SepharoseTMFastFlow(1.2×20cm)为填料,用2MNaCl溶液与Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰并作活性检测。测定每步纯化后所收集酶液的蛋白质含量和胰蛋白酶活性并计算产率和纯化倍数,结果显示胭脂鱼胰蛋白酶的最终的产率为8%,纯化倍数达到了185.3倍。
2.胭脂鱼胰蛋白酶的化学修饰
以高碘酸钠氧化活化的右旋糖苷T-70对已纯化的胰蛋白酶进行修饰,在不同的反应条件下得到不同修饰率的胰蛋白酶,优化修饰条件后得到较高修饰率和酶活保留的修饰产物,即高碘酸钠与右旋糖苷的比例为1∶1,活化后的右旋糖苷与胰蛋白酶的比例为5∶1,活化反应最适pH为6,最终酶保留活力53%,修饰率为87%。
3.修饰前后胰蛋白酶性质的比较
采用SDS-PAGE电泳法测定修饰前后的分子量变化,得到纯化的胭脂鱼胰蛋白酶呈现出单一条带,其分子量大约为26KDa。修饰酶经纯化后在分子量约为66KDa处呈一条主带,但下有小分子量的弥散带。修饰前后胰蛋白酶的动力学常数(Km)测定以BANPA为底物,采用双倒数作图法,测得结果分别为0.074mM、0.21mM。
对修饰酶和自然酶的最适温度、最适pH、酸碱稳定性、酶促反应动力学、热失活动力学进行了分析。结果显示自然酶最适温度为60℃,最适pH为8.5,修饰反应并没有改变酶的最适温度和最适pH,酸碱稳定性修饰前后大致趋势一致。酶促反应动力学表明修饰酶的催化效率低于原酶,主要原因是修饰酶的底物亲和力1/Km下降。