前言瘢痕疙瘩(Keloid)是易感个体在皮肤损伤修复过程中成纤维细胞大量增殖,胶原基质大量分泌形成的良性真皮肿瘤,其临床特征为瘢痕组织超越原损伤范围持续生长,侵袭周围外观正常皮肤,手术切除后容易复发。国内外学者对其进行了大量研究,但发病机制目前仍不清楚。近年来,遗传学方面的研究已成为瘢痕疙瘩基础研究的主要方向,其中分子遗传学方面的研究已成为最新热点。Marneros等通过全基因组扫描将一个日本人瘢痕疙瘩家系易感基因定位于2q23,一个非裔美国黑人家系定位于7p11,提示瘢痕疙瘩的发生存在明显的遗传异质性。痕痕疙瘩的人群患病率报道不一,分别从扎伊尔的16%到英国的不到1%;不同人种的患病率相差很大,深色人种与浅色人种的患病率从2:1到19:1不等。大多数瘢痕疙瘩病例呈散发状态,但也存在着家庭聚集现象。在南印度的一项1000人的流行病学调查中有家族史者占1.9%,另一项247人的研究表明瘢痕疙瘩患者中有家族史者占3.2%。有些综合症也可以合并瘢痕疙瘩,并且也表现为家族聚集现象,如Rubinstein-Taybi综合症和Goeminne综合症,但它们是与瘢痕疙瘩不同的疾病。国外流行病学调查结果表明瘢痕疙瘩患者无性别差异,发病高峰集中在10-30岁年龄段;安徽医科大学进行的南方汉族瘢痕疙瘩流行病学调查结果与国外流行病学调查结果相似,但是目前尚缺乏北方汉族瘢痕疙瘩临床流行病学资料。单核苷酸多态性(SNP)是近年来出现的第三代遗传标记,对疾病的早期风险性评估、早期诊断与预防以及相应的治疗等诸多方面有巨大的应用价值。单核苷酸多态性,尤其是位于蛋白编码区和表达调控序列的SNP可能具有特定功能作用,并可以影响疾病发生的易感性。基质金属蛋白酶(metal matrix proteinase,MMPs)是一个高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族,是细胞外基质降解过程中最主要的蛋白水解酶,在伤口愈合、恶性肿瘤的浸润与转移等病理生理过程中发挥重要作用。MMPs家族至少发现与人类有关的17个成员,根据结构及酶与底物亲和力的不同,主要将MMPs分为4组:①胶原酶(collagenase)以MMP-1为代表,主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖;②明胶酶(gelatinase)MMP-2、MMP-9,又称为明胶酶A、B,主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维;③基质溶解素(stromelysin)MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11,主要作用于纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ型胶原及MMP-1、MMP-8、MMP-9;④膜型金属蛋白酶(membrane-type matrix proteinase)MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP,主要作用于明胶Ⅳ型胶原、MMP-2。目前发现MMPs基因有一些多态性位点可以影响MMPs的结构与功能,且与炎症及纤维化疾病的发生发展有关。其中MMP-9基因尤其受到关注。人类MMP-9基因定位于染色体20q12-13,研究发现MMP-9有两个多态性位点,C-1562T和CA-repeat,其中C-1562T研究较多。白细胞介素-6(Interleukin 6)是炎症起始阶段的一个重要致炎因子,具有广泛免疫调节作用,通过诱导多种细胞合成和分泌多种急性期蛋白促进感染时多形核白细胞产生、活化、促进B细胞增殖、分化及产生免疫球蛋白、促进T细胞增殖、分化等,在急性期炎症反应中扮演着十分重要的角色。1998年Daniel Fishman首先发现了启动子-174位点存在G/C多态性,发现这种多态性对于IL-6基因表达具有调控作用。对IL-6启动子区多态性的临床研究有助于从免疫基因的角度理解疾病的发生、发展规律,探索携带不同等位基因的个体对某一疾病的易患性。本研究从流行病学调查着手,历时三年,在临床收集680瘢痕疙瘩病例,进行详细的问卷调查,从这些患者中采集120例志愿者肘静脉血2毫升,应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction restriction fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)方法和测序结合对120例辽宁籍汉族瘢痕疙瘩患者和180例种族与地域相匹配的正常对照者的MMP-9 -1562C/T基因多态性位点和IL-6-174G/C基因多态性位点进行检测,以探讨这些功能性SNP位点与瘢痕疙瘩的遗传易感性的关系,为揭示瘢痕疙瘩遗传学发病机理提供重要线索。材料和方法一、研究对象1、病例组纳入流行病学调查的680例瘢痕疙瘩患者为中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊及住院患者,均为北方汉族人,符合临床诊断标准:增生瘢痕组织超过原损伤范围,病程大于1年。其中知情同意后采血的120例纳入多态性研究,均为彼此间无血缘关系的北方籍汉族人,其中男性54例,女性66例,发病年龄12～52岁,平均年龄26.4±5.9岁。2、正常对照组180例,为随机抽取的健康体检志愿者,北方汉族人,其中男84例,女96例,平均年龄24.3±2.7岁,彼此间无血缘关系,排除瘢痕疙瘩病史及家族史。二、实验材料10%SDS、EDTA、蛋白酶K、Tris饱和酚、氯仿、醋酸钠、无水乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、LA Taq酶。三、实验方法1、采用标准的调查问卷,利用SPSS 13.0软件分析流行病学调查数据。2、应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对MMP-9-1562C/T及IL-6-174G/C等位基因进行分型。3、利用测序方法验证PCR-RFLP结果。四、统计学处理利用SPSS 13.0软件分析流行病学调查数据。Hardy-Weinberg平衡吻合性检验、组间基因型频率及等位基因频率的差异性比较采用x~2检验,并以优势比(oddsratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI)表示相对风险度。使用SPSS13.0软件分析数据,认为P＜0.05有统计学意义(具有显著性差异)。结果1、瘢痕疙瘩发病无性别差异;发病高峰集中在10～30岁;有家族史患者发病年龄提前,而且有家族史患者更容易发生多发性瘢痕疙瘩。2、瘢痕疙瘩与MMP-9-1562C/T基因多态性的相关研究(1)瘢痕疙瘩组和正常对照组人群MMP-9-1562C/T基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。(2)瘢痕疙瘩组MMP-9-1562C/T等位基因的频率与正常对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。3、瘢痕疙瘩与IL-6-174G/C基因多态性的相关研究(1)瘢痕疙瘩组和正常对照组人群IL-6-174G/C基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。(2)瘢痕疙瘩组IL-6-174G/C等位基因的频率与正常对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。结论1、流行病学调查结果显示北方汉族瘢痕疙瘩患者发病无性别差异;发病高峰集中在10～30岁;有家族史患者发病年龄提前,而且更容易发生多发性瘢痕疙瘩。2、北方汉族瘢痕疙瘩组和正常对照组人群MMP-9-1562C/T基因频率已达到Hardy-Weinberg遗传平衡。3、北方汉族MMP-9基因T等位基因的存在可能与瘢痕疙瘩的形成和发展有一定的相关性。4、北方汉族瘢痕疙瘩组和正常对照组人群IL-6-174G/C基因频率已达到Hardy-Weinberg遗传平衡。5、北方汉族IL-6-174G/C等位基因与瘢痕疙瘩的形成和发展可能不具有相关性。