1研究背景及目的人类肿瘤的启动、发生与进展是一个涉及到多基因、多步骤、多因素的复杂过程。结直肠癌(Colorectal cancer CRC)是常见消化道恶性肿瘤,其发病率逐年上升。目前采用高通量技术的“组学”研究已广泛应用于肿瘤的机制探讨及分子表达谱的构建。建立在各种差异表达谱上的肿瘤分子分型研究已经广泛开展,这为肿瘤的个体化治疗提供基础。为探讨结直肠癌的发病机制,揭示差异蛋白质分子的动态表达趋势并构建分子分型模式,本研究采用先进的蛋白质组学技术构建不同临床分期CRC蛋白质差异表达谱,绘制差异蛋白质的动态表达曲线图；通过对差异分子的预后分析,筛选并建立CRC预后相关的分子分型,使CRC从常规诊断进入到分子诊断水平,为实现CRC的个体化治疗提供理论依据。2材料和方法收集不同临床分期CRC标本及病理资料,建立CRC标本库。取不同临床分期CRC组织样本20例进行荧光差异双向电泳(Two-dimensional differential in gel electrophoresis,2D-DIGE),其中临床TNMⅠ～Ⅳ期CRC组织标本各5例,Ⅰ期癌旁远端自身正常对照标本5例,采用DeCyder全自动分析及统计系统进行差异分析,构建不同临床分期CRC蛋白质差异表达谱。1)利用EDA模块对差异蛋白质动态表达趋势图进行聚类分析及主成分分析,采用Cluster3.0软件进行非监聚类分析,探索蛋白质表达变化规律。同时与采用相同标本进行基因和转录组学研究的其它课题组结果进行差异分子表达水平的组学对接研究。2)通过MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定差异蛋白质,并对其功能、细胞定位及相互作用网络等进行生物信息学分析。最后通过Westernblots和免疫组化实验验证差异蛋白质的表达情况。3)对103结直肠癌组织芯片标本进行随访,获得生存资料。利用Kaplan-Meier生存分析方法对临床病理资料进行预后研究；通过判别分析与生存分析相结合的方法建立不同临床分期的判别函数,构建不同的CRC预后分子分型模式,同时评估预后分子分型模式的准确率、灵敏度以及特异性。3结果1)通过对不同临床分期25个结直肠蛋白质样品进行2D-DIGE实验,扫描后获得高质量的荧光凝胶图谱。DeCyder分析发现4863匹配的蛋白质点,对不同临床分期CRC及正常组蛋白质进行的两两t-test检测(p<0.05；Av. Ratio≥2)得到任意两组之间的蛋白质差异表达数目,其中Ⅰ期与正常组之间差异表达蛋白质点较多,而Ⅱ期与正常组之间差异较小。5组间采用单因素方差分析(one-way-ANOVA;P<0.05)得到199个差异表达蛋白质点(每组≥3/5患者有表达)。其中在肿瘤中表达上调的67个分子、表达下调的114、在不同临床分期中的表达可高于或低于正常组织的有18个分子。2)通过对199个差异蛋白质点的模式聚类分析得到4种Kmean’s聚类结果和8种Som聚类结果。模式聚类结果很好的展示了差异蛋白质点在不同发病阶段的动态变化趋势,揭示了蛋白质动态变化规律。主成分分析和非监聚类分析发现晚期(Ⅲ与Ⅳ期)CRC患者之间不能形成阶段特异性聚类。通过与其它课题组在基因、蛋白质、转录水平的表达对接研究后得到表达改变基本一致的3个分子CA1、CA2、ANXA4。3)通过质谱鉴定了40个差异蛋白质分子,其中上调10个,下调27个,上-下调3个。生物信息学分析结果提示差异蛋白质功能主要涉及到疾病的突变、蛋白质折叠、信号传导、氮代谢途径等,部分蛋白质还涉及到糖酵解／糖异生途径、乙酰化作用、氧化还原酶等能量代谢。其中GAPDH、TPIl、ALDOA、YWHAZ是23个差异蛋白质相互作用网络的中心分子。Western blots和免疫组化实验验证差异蛋白质在5组中的表达变化情况与2D-DIGE实验基本一致。4)通过对不同临床分期CRC患者的预后随访,获得84位患者的生存资料,建立OS (overall survival)状态和OS时间生存资料表。中位生存时间为：30.56月,OS生存率为71.4%(60/84)。临床病理资料中“年龄”和“有无淋巴结转移”这两项指标与结直肠癌患者预后密切相关(p<0.000)。TNM分期对早期和晚期CRC患者之间的预后判断较好(p<0.001),但无法判断TNMⅢ与Ⅳ期患者的预后(p=0.483),而实际两者之间预后具有较大的差异(p<0.000)。来自模式Som 1、2、5的ALDOA, PPIA, ANXA4, GRP78, CA1, YWHAZ, ALDOA 6个差异表达蛋白质分子中GRP78和YWHAZ蛋白质的表达与Ⅲ-Ⅳ期CRC患者的预后相关(p=0.015；p=0.039)。除ANXA4蛋白质外另外5个蛋白质分子的表达情况均与Ⅰ-Ⅳ期CRC患者的预后相关(p<0.05)。采用以LOOCV为主的判别分析与生存分析相结合构建了多个判别函数,利用判别函数1-4构建的4个分子分型模式对不同临床分期的CRC患者具有较好的预后判断评估价值。其中GRP78, ALDOA,CA1和PPIA这4个蛋白质的分子分型模式能对CRC I-IV期预后判断(P<0.001),准确率为74%；GRP78, ALDOA, CA1这3个分子建立的判别函数-2可以有效判断Ⅲ和Ⅳ期患者的预后(P<0.001),准确率为76.9%。而利用6个蛋白质共表达水平构建的判别函数-3对Ⅲ期患者预后判断的准确率达81.3%；ALDOA和YWHAZ构建的分子分型模式判别Ⅳ期患者的预后的准确率达84.2%。4讨论1)通过构建结直肠癌不同临床分期蛋白质差异表达谱,并进行模式聚类分析,发现差异表达蛋白质在CRC发生、发展过程中呈动态变化趋势；其分子改变较临床病理特征改变发生的更早；不同表达模式代表蛋白质在CRC的发生和发展中具有不同作用。2)不同组学的对接研究结果提示,基因、蛋白质以及miRNA表达水平的一致性改变可以增加差异分子改变的可信性度。但深层次的组学对接不能仅停留于分子表达水平的对接,更主要的是涉及功能作用和调控机制等重要因素的对接。且表达水平改变的一致和不一致都暗示着同样重要的生物学改变机制。3)传统的TNM分期无法对CRC晚期患者提供很好的预后判断,而基于差异表达蛋白质的基础上建立的分型模式能有效预测Ⅰ-Ⅳ期CRC患者的预后,尤其是对有淋巴结及远处转移患者的预后判断更为准确。5结论1)本实验构建了结直肠癌不同临床分期之间的差异蛋白质表达谱,首次建立了结直肠癌不同临床分期差异蛋白质的动态表达模式。2)整合了结直肠癌不同临床分期的基因组、蛋白质组及转录组信息,首次进行结直肠癌不同临床分期差异分子在表达水平的组学对接研究。3)建立了结直肠癌不同临床分期患者的预后分子分型模式。生存分析证实基于分子的基础上建立的分型模式在判断预后方面较TNM临床分期更有意义,尤其是对有淋巴结及远处转移患者的预后判断更为准确。